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褪黑激素影响Bisphenol-A-Induced结肠癌细胞株的细胞毒性和遗传毒性,正常牙龈细胞系,骨髓干细胞系

*通信:

穆罕默德Shokrzadeh部门毒理学医学科学和药理学、马赞达兰大学,伊朗,电子邮件:ebrahimirouya@gmail.com

文摘

最常见的人体接触双酚a (BPA)是由口腔摄入。它包括基因毒性,氧化应激,内分泌紊乱,致突变性和致癌性在体外和体内模型。褪黑激素称为自由基清除剂和强抗氧化剂代理。本研究发起调查的作用褪黑激素可行性和遗传病的正常人类牙龈成纤维细胞(HGF),结肠癌症(MKN45)和骨髓干细胞行暴露于BPA。为此,MTT和彗星试验进行评估和细胞毒性基因毒性BPA和性能褪黑激素的角色。本研究的结果表明BPA接触导致增加氧化压力参数包括MDA、ROS和减少谷胱甘肽含量。当前的研究证明了细胞毒性和基因毒性BPA的保护作用的影响褪黑激素为防止细胞毒性和双酚a引起的DNA损伤。

关键字

双酚A;褪黑素,麻省理工;彗星;细胞毒性;基因毒性

介绍

双酚a (BPA)。2,以叔(4-hydroxyphenyl)丙烷)合成化学,作为一个单体,增塑剂、和酚类化合物被广泛应用于生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂生产的消费产品,如食品罐头,饮料容器、婴儿奶瓶,医学油管,玩具,水管,牙科密封剂、眼镜等,一些纸制品和粘合剂、防护涂料、粉末涂料、汽车镜头,保护窗户玻璃,建筑材料、紧凑的磁盘,光学镜片,热敏纸,纸涂料、电气和电子部件的封装(1- - - - - -7]。BPA是xenoestrogen,能够引发独特estrogen-signaling途径对人体健康的潜在后果。此外,一个不可挽回的健康双酚a的影响与早期暴露在妊娠期和新生儿时期(8]。普遍使用双酚a生产消费产品导致的检测样本的饮食产品,人类的液体,水、粉尘、污水、和室内、室外空气和环境媒体(6,9]。BPA是发布的食品和饮料容器特别是加热,所以人体接触已经广泛和持续通过食物链(1,2,7]。接触双酚a的主要负责的问题超过90%的整体人类在所有年龄组是通过摄入受污染的食物,因此从上消化道组织暴露于non-conjugated BPA(活性形式)10),最常见的方式,人类应该了BPA接触口腔摄入,但是暴露在工作场所可能发生在生产过程中通过吸入。(7]。考虑其普遍发现在人类生活中,环保局将BPA在第三毒理学优先指数(ToxPi)在309环境化学品使用ToxCast项目(9]。这件事导致了实施禁止使用BPA在儿童护理产品包括奶瓶在欧盟、美国和加拿大,它也被禁止在热在日本收到论文(3,9]。对该化学剂的需求稳步增长在不同行业在最近几年;所以有崛起的担忧BPA由于其毒理学特性包括基因毒性,氧化应激,内分泌紊乱,致突变性和致癌性,已经找到了在体外和在活的有机体内模型(11]。近年来,双酚a注意到大量的公共和研究者的关注,因为它可能与多种毒性和不良健康影响,使得科学社会工作BPA不良反应的预防和保护路径。(1,3,11]。BPA曝光器导致MDA浓度增加和减少的谷胱甘肽含量称为表明增加活性氧的生成,导致脂质过氧化(1]。培养实验细胞和实验室动物表明BPA的积累特征及其参与在几个重要器官功能,包括睾丸、大脑、心脏、肝脏和胰腺。研究结果也证明氧化的关系压力和线粒体功能障碍BPA的不利影响12,13]。褪黑激素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)被称为吲哚胺主要是发布的松果体(4,5]。自由基清除剂是其重要的特征之一,具有显著的抗氧化活性5,11]。最有毒的自由基和羟基自由基及时回收该代理直接进行清除过氧亚硝基阴离子,一氧化氮,单线态氧和过氧化氢自由基。褪黑激素引起mRNA的抗氧化酶超氧化物歧化酶。另一个抗氧化酶包括谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶也激动的褪黑激素。其他的活动褪黑激素是参与,包括pro-oxidative酶,抑制一氧化氮合酶,螯合过渡金属离子,防止细胞膜恶化,减少脂质过氧化反应(11]。维生素C和防治作用的保护特性与BPA-induced毒性报道(11]。母鸡在这项研究中,我们选择褪黑激素作为保护剂对其潜在的抗氧化活性。本研究的目的是调查褪黑激素保护作用对BPA-induced细胞毒性和遗传毒性三个细胞系包括结肠癌癌症细胞系,正常牙龈细胞系,骨髓干细胞线。

材料和方法

化学物质

下面的化学物质从默克公司购买化学公司:BPA,褪黑素,甲醇,MTT染色,氯化钾(氯化钾)、盐酸(HCl);DMSO,吩嗪methosulfate (PMS)、青霉素、链霉素、胎牛血清、谷酰胺,和磷酸盐(PBS)、DMEM培养基从σ-奥尔德里奇化工公司购买。所有化学试剂都获得最高和最纯粹的年级。

细胞培养

三个细胞系包括正常的人类牙龈成纤维细胞细胞系(HGF),结肠癌症细胞系(MKN45),骨髓干细胞线(MSC)用于本研究获得在德黑兰伊朗的巴斯德研究所细胞库。这些细胞生长在37°C和5%的公司₂在DMEM培养基。

浓度的测试褪黑激素和双酚a细胞毒性的测定,基因毒性和氧化压力参数

褪黑素和双酚a是准备在四个浓度分别包括50μM 100μM 200μM 400μM和0.5μg /毫升,5μg / ml, 50μg / ml, 100μg /毫升。50μg /毫升的BPA作为阳性对照组和细胞培养基被认为是负面的对照组。细胞可行性研究后提到细胞系24和72 h接触BPA浓度在0.5μg / ml, 5μg / ml, 50μg /毫升,100μg /毫升。基因毒性双酚a是由彗星试验24和72 h后暴露在0.5μg / ml, 5μg / ml, 50μg /毫升,100μg /毫升浓度。顺铂是一个积极的控制是用于评估BPA-exposed细胞生存能力。的褪黑激素BPA-induced细胞毒性和作用基因毒性评估在50岁μM 100μM 200μM 400μM浓度;50μg /毫升的BPA用于细胞毒性基因毒性归纳。实验进行了一式三份,重复三次。

细胞毒性试验

MTT试验是一种受欢迎的方法评估细胞的可行性。这个实验是基于麻省理工的减少,一个黄色的水溶性四唑染色为主,通过线粒体脱氢酶紫色甲瓒晶体。甲瓒产品溶解在DMSO溶液,然后分析spectrophotometrically使用ELISA阅读器设备在570 nm和630 nm (14- - - - - -17]。

分析归纳彗星的遗传毒性试验

DNA链断裂感应被彗星试验化验所描述的冯Bardeleben et al ., 2002。彗星试验是用来评估两个因变量:全球DNA损伤和氧化损伤引起的一种特殊的DNA损伤核苷酸的氧化。彗星是由显微镜和可视化量化的决心“橄榄尾巴时刻”(移动)使用计算机软件(4.02固美、动力学成像、英国)。五十细胞分析了每测量计算的平均值7,10,18]。

生化决定

的协议Buege和欧斯特(1978)被用来估计脂质过氧化作用。脂质过氧化产物丙二醛(MDA),测定硫代巴比土酸试验,基于MDA与硫代巴比土酸反应给硫代巴比土酸活性物质(TBARS),一个红色的物种在530纳米吸收。报告的MDA含量摩尔数的值/毫克蛋白[9,11,19,20.]。谷胱甘肽是估计只有细微的不同协议Jollow et al。(1974)。上层清液混合磷酸钾缓冲,0.1米,pH值7.4,和反应是由DTNB,和吸光度测量在412海里。谷胱甘肽水平在摩尔的值/毫克的蛋白质。摩尔消光系数的计算结果都是采用1.36×104米⁻¹厘米⁻¹(9,21]。DCFH - DA用于测定细胞内活性氧的生产物种(ROS)。DCFH-DA荧光,非极性的,和电中性化合物,可以很容易地通过细胞膜进入细胞。细胞内的活性氧氧化DCFH高度光纤荧光。对待PBMCs被孵化20μM DCFH-DA 1 h在37^°c .荧光决定活性氧的增加记录的发射波长530 nm使用485 nm作为激发波长(9,22]。

统计分析

数据提出了均值±SD(标准差)。统计分析是由单向方差分析图基测试紧随其后。17 SPSS软件被用于统计分析。统计学意义是视为P < 0.05。

结果

细胞生存能力

双酚a在胶质瘤的可行性的影响,MKN45, MSC细胞使用MTT试验进行评估。24 h后曝光,BPA导致减少在提到细胞系细胞生存能力。在图1很明显,有显著性差异(P < 0.00001)双酚a的细胞毒性效应细胞与对照组相比。MTT分析也用于评估褪黑激素作用在细胞毒性引起的双酚a在提到细胞系。图1中可以观察到,调查显示的结果褪黑激素显著(p < 0.0001)浓度(100,200,400μM)引起提高细胞生存能力相比双酚a组。细胞系都暴露在50μg /毫升BPA和不同褪黑激素浓度研究褪黑激素的效果。

彗星试验

彗星试验检测DNA链断裂是一个敏感的方法在单个细胞水平;彗星试验运行在胶质瘤、MKN45和MSC细胞暴露于各种浓度BPA和褪黑激素。图2显示了尾巴时刻通过对MKN45细胞彗星试验获得的。有显著增加尾时刻暗示DNA损伤或碎片。DNA损伤被发现显著等四个浓度0.5,5、50和100μg /毫升的BPA与p < 0.0001 MKN45细胞。因此,BPA是基因毒性。近距离观察的结果在图2中,我们还发现BPA能显著增加(p < 0.0001)基因毒性影响干细胞线。增加尾巴时刻观察到浓度超过5μg /毫升的BPA对MSC细胞。在图2中,很明显有一个尾巴时刻浓度显著增加5,100μg HGF /毫升的BPA细胞这表明BPA的基因毒性效应。彗星试验也被用于调查的影响褪黑激素在BPA-induced基因毒性在四个浓度。因为它可以发现在图2中,结果表明,它可以显著降低(p < 0.0001)杆尾部的时刻细胞系在100年、200年和400年μM褪黑素的浓度。显著(p < 0.001)降低尾时刻也观察到的被暴露在50μM的褪黑激素。褪黑激素的浓度的增加,其基因毒性增加减少的影响。图2所示,显著(p < 0.0001)降低被发现的基因毒性BPA的HGF和MKN45细胞系,被暴露于100年,200年和400年μM浓度褪黑激素相比于对照组。数据还显示,褪黑激素提到细胞株在50μM浓度引起显著降低(p < 0.01)基因毒性BPA与控制。

活性氧

活性氧物种增产超过其胞内阈值浓度由于外界刺激导致发生氧化应激。理解是否BPA是由于氧化诱导的细胞毒性压力在胶质瘤,MKN45, MSC细胞敞口,细胞内活性氧物种使用DCFH-DA作为探针检测进行了。根据数据表示在图3中,它是发现活性氧含量细胞系暴露在BPA浓度5,50和100μg /毫升明显(p < 0.0001)较对照组升高表示它的细胞毒性效应。BPA也导致显著增加(p < 0.01)的ROS在0.5μg /毫升浓度与对照组相比。我们认为BPA可以通过氧化应激产生的细胞毒性。图3显示的荧光强度下降百分比DCF治疗褪黑激素在细胞暴露于BPA。它演示了一个稳定的强度和降低显著(p < 0.0001)在不同浓度的降低褪黑激素包括100年、200年和400年μM对照组相比也就是暴露于BPA。褪黑激素也显著下降(p < 0.01) ROS数量在50岁μM浓度与对照组相比,证明其对BPA-induced细胞毒性的保护作用。

估计的谷胱甘肽和脂质过氧化作用

谷胱甘肽被称为一个重要的自由基清除剂,主要是参与解毒过程包括抑制活性氧;减少谷胱甘肽含量和MDA含量的增加表明氧化压力归纳。关于活性氧的主要观点是其反应至关重要大分子如脂质氧化,导致他们的MDA导致膜脂质损伤(8]。证实BPA是否能够诱导氧化应激,谷胱甘肽和MDA水平的估计。图4和图5显示的影响地位BPA BPA-exposed细胞系的谷胱甘肽和MDA含量。谷胱甘肽含量显著减少,BPA-exposed MDA水平上升细胞5、50和100μg /毫升浓度(p < 0.0001)。这些数据表明,BPA-induced ROS -介导的氧化压力负责缓解谷胱甘肽含量和MDA的含量的增加8]。

的影响褪黑激素谷胱甘肽的耗竭内容和MDA水平上升引起的双酚a表示在图4和图5。发现谷胱甘肽含量明显(p < 0.0001)提高细胞系暴露于100年,200年和400年μM浓度褪黑激素与对照组相比。褪黑激素在50岁μM浓度也导致显著增加(p < 0.05)的谷胱甘肽含量与对照组进行比较。的结果褪黑激素评价MDA在细胞暴露于不同浓度的量褪黑激素显示显著(p < 0.0001)降低为100、200和400年μM浓度与对照组相比。的褪黑激素效应在50岁μM浓度没有显著差异与对照组相比。

讨论

BPA作为一种内分泌干扰物)是一个单体的聚碳酸酯塑料和环氧树脂和聚苯乙烯树脂的组成部分11]。人类暴露于BPA普遍存在由于各种用于消费产品(2]。BPA是发布的食品和饮料容器,所以人类暴露于它是普遍和持续通过食物链(1]。BPA毒性的因素涉及包括脂质过氧化和一代的自由基造成氧化压力(11]。褪黑激素独特的特征包括低毒性和跨越生物障碍的能力使它能够防止氧化损害DNA,因此它被称为自由基清除剂,能中和各种威胁因素(1,11,23]。本研究开始进行调查褪黑激素影响BPA-induced基因毒性和细胞毒性MKN54、HGF和干细胞行。我们使用褪黑激素作为一个对BPA-induced保护剂基因毒性褪黑激素和细胞毒性考虑潜在的抗氧化活性和保护作用。

从目前获得的数据研究表明,双酚a导致减少细胞生存能力比例是由于其细胞毒性效应。它也发现褪黑激素能够增加细胞系的细胞生存能力比例暴露于BPA。彗星试验的结果表明,有一个显著增加尾部的时刻表明接触双酚a的细胞系的DNA损伤;另一方面,一项调查对BPA-induced褪黑激素的影响基因毒性显示,褪黑激素能显著减少尾部时刻细胞系暴露于BPA。生化因素决定表明BPA会破坏生化剂的状态就是明证脂质过氧化作用,升高活性氧物种和减少谷胱甘肽含量。在最近的研究中,褪黑激素明显调制状态的生化因素细胞系暴露褪黑激素+双酚a。这被降低MDA的含量和活性氧的谷胱甘肽含量增加褪黑激素+ BPA-exposed细胞系相比BPA-exposed组。一个氧化和清除的属性褪黑激素使它能够保护DNA和脂质等氧化剂BPA (1]。

在体外研究由Shoeb Ikhlas等人在2019年批准了我们的研究结果。他们用MTT测试评估细胞毒性细胞生存能力由于减少通过测量细胞凋亡或坏死(9]。我们的研究结果也符合先前Hercog拉拉·金和他的同事在2019年的报告。他们表明BPA基因毒性潜在及其类似物如个基点,带通滤波器,BPAF、以及它们的混合物,其影响在选定的异型生物质的代谢基因的表达,氧化应激反应,对HepG DNA损伤₂细胞(17]。

另一项研究符合我们的细胞毒性和彗星试验结果由船底座Ramosa和他的同事们对细胞毒性和基因毒性的影响环境相关浓度BPA与阿霉素和交互。彗星试验结果在他们的研究表明DNA损伤Hep-2的结果细胞暴露于BPA的协议与我们的研究(10]。

生化因素决定的结果与先前的报道是一致的,穆罕默德·a . El-Missiry和他的同事们褪黑激素改善氧化应激,调节死亡受体通路蛋白,保护对鼠大脑BPA-induced凋亡,表达褪黑激素拥有几个独特的物理和化学性质抗氧化剂使它很容易交叉生物膜和细胞溶质,细胞核和线粒体1]。

另一项研究证实了我们的结果,这是由Anongporn Kobroob等都在双酚A的破坏性影响肾脏和褪黑素的保护:新兴的证据在活的有机体内和在体外研究。他们不仅发现BPA暴露增加氧化剂分子一氧化氮(NO)也减少了抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)酶水平和超氧化物歧化酶(SOD)在肾组织。与当前的研究一致,BPA已被证明在各种刺激氧化损伤细胞和器官在体外和在活的有机体内实验(12]。Sameya Anjum和同事的研究的结果褪黑激素改善双酚A-induced生化睾丸线粒体毒性的鼠标还批准了我们的发现。这是发现BPA治疗显著影响谷胱甘肽作为代理人在细胞生存能力至关重要。表示,谷胱甘肽单独或与其他蛋白质结合可以保护细胞免受脂质过氧化作用。结果表示,褪黑激素作为一种强有力的抗氧化剂能够改善BPA-induced氧化应激。他们也显示褪黑激素作为自由基清除剂可能会涉及到其电子基的能力。据报道,长期的褪黑激素摄入导致线粒体的数量增加细胞(11]。

本研究的结果符合的结果Shoeb Ikhlas等所有在2019年评估双酚a类似物的细胞毒性研究基于他们的氧化和基因毒性潜在使用人类外周血细胞。他们认为虽然BPA基因毒性在本质上是相互冲突的,一些研究发现BPA能诱导小鼠细胞淋巴瘤细胞DNA损伤,MCF-7,细胞和鸡DT40细胞在一些报道指出其不会函数对中国仓鼠卵巢细胞,肠细胞系(LS174T),肝癌细胞系(HepG₂)和肾细胞系(ACHN) [9]。我们的研究结果与之前的研究结果显示DNA损伤也在协议研究BPA和的影响褪黑激素治疗男性生殖的DNA损伤细胞2013年,由Hong-Juan吴和他的同事们。在他们的研究中,观察到显著增加的彗星参数粗线的精母细胞的大鼠暴露于BPA。此外,他们建议代谢物的BPA可能与DNA反应特别是谷胱甘肽水平低在细胞中(7]。在另一项研究中,histomorphological,免疫组织化学和TUNEL分析培养测试是由邓主任和他的同事们为了调查是否添加褪黑激素培养基将防止BPA在睾丸的不利影响,结果表明,10μM褪黑激素能够显示保护功能对BPA的协议我们的研究结果对吗褪黑激素保护作用在接触双酚a的细胞系(24]。另一项研究是由Hyo-Jin公园和他的同事们将调查的氧化作用褪黑激素针对BPA-derived超氧化物在猪卵母细胞成熟。在他们的研究褪黑激素保护作用是认证有关超氧化物生产期间接触双酚a在卵母细胞成熟(25]。批准的其他研究,我们的研究结果与阿卜杜拉萨利赫M,和他的同事们在评估BPA诱导氧化压力在人类红细胞表面在体外褪黑素及其改进。他们发现BPA曝光器血红细胞增加氧化应激引起的,褪黑激素降低了BPA-induced氧化压力在这些细胞(26]。

Neslihan Coşkun Akcay和同事的发现与研究相关的影响褪黑激素可能发生在adipocytokines和肝组织的损害共同服用果糖和双酚a (BPA)的,是在协议与我们的数据;他们表示,合并施打BPA和果糖引起脂质过氧化增加由于增加氧化应激水平。另一方面褪黑激素治疗诱导抗氧化酶活性,减少脂质过氧化水平(27]。

结论

总之,目前的研究提供了令人信服的证据证明BPA有害的影响干细胞行,HGF和MKN45细胞。目前的研究证实BPA接触导致增加氧化压力因素,包括MDA、ROS和减少谷胱甘肽含量。BPA接触也诱导脂质过氧化反应证明线粒体膜的脆弱性。BPA有清楚地显示在三个细胞系细胞毒性。调查的某些氧化压力参数显示,它诱导活性氧过剩和脂质过氧化反应,还导致损耗的谷胱甘肽的水平。进一步研究引起DNA损伤表明,关于他们的能力。因此,我们得出结论,BPA能通过氧化诱导细胞毒性压力和基因毒性。本研究指出褪黑激素保护作用BPA-induced细胞毒性和基因毒性。这是显示褪黑激素可以减弱BPA-induced ROS、MDA增加和减轻DNA损伤。在其他的手褪黑激素可以补偿的谷胱甘肽减少BPA接触引起的。

总之我们强调的重要性继续调查的有益的品质褪黑激素由于其独特的功能,包括无毒,价格低廉,容易获得和潜在的保护药物剂防止细胞毒性和有毒化学物质引起的DNA损伤特别BPA。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

引用

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