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，卷:15(1)

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序贯诱变法改良耐盐放线菌产蛋白酶菌株

*通信:

Payal Mehtani印度斋浦尔iisuniversity生物技术系电话:9783307166;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

蛋白酶是一种天然的生物催化剂，由于其巨大的范围和特异性引起了全球科学家的关注，以寻找更好的微生物来源来增强酶的生产。然而，来自芽孢杆菌的细菌蛋白酶已经得到了广泛的研究和鉴定，而对放线菌产生的蛋白酶的研究较少。在目前的调查中，a蛋白酶从印度拉贾斯坦邦的Sambhar盐湖水中分离到耐盐嗜碱放线菌A1F2，鉴定为链霉菌sp.为了进一步提高产量，对分离物进行吖啶橙、溴化乙啶和紫外线辐射的顺序随机诱变。的蛋白酶从亲本到最终突变体，摇瓶产量增加了约2.2倍。结果表明，序贯随机诱变过程比单一诱变剂处理更有效。过度活跃蛋白酶生产突变体可用于工业应用。

关键字

吖啶橙;溴化乙锭;蛋白酶;序贯随机诱变;紫外线辐射

简介

蛋白酶是进行蛋白水解的酶，单独占65% [1占全世界总数的一半出售在其他两大工业酶组，即脂肪酶和淀粉酶中，酶的比例从Rao等人报告的59%上升。[2］．蛋白酶被应用于各种行业，如洗涤剂、皮革、丝绸制造、食品、制药工业，甚至在生物修复过程中[3.］．在所有类型的蛋白酶中，碱性蛋白酶在工业上应用最多[2］．许多研究人员也报道了碱性蛋白酶在角、羽毛和毛发纤维蛋白水解中的应用[4，5]，用明胶水解从x射线胶片中回收银[6-8］．

虽然来自细菌的蛋白酶被广泛地表征，但很少关注放线菌产生的蛋白酶。放线菌已被广泛研究用于生产抗生素[9，10］．现正大规模探索利用放线菌生产酵素的方法[11］．

从格鲁吉亚不同地区的土壤中分离出来的中温和嗜极放线菌显示蛋白酶活动(12］．在印度，属的成员小单孢菌属而且链霉菌属从孟加拉湾Pudimadaka海岸分离出来的一种酶显示出蛋白水解活性，因此为从这种嗜盐生境中发现工业上重要的酶提供了巨大的潜力[13］．沙特阿拉伯亦报告有一种具有蛋白水解活性的嗜碱放线菌[14］．

工业上对超材料的需求越来越大蛋白酶产生微生物菌株。的产量蛋白酶产量取决于介质中碳源和氮源的类型。因此，通过优化这些营养来源和其他培养条件，可以提高产量。此外，利用物理和化学诱变剂可以产生突变体，以提高微生物的效率蛋白酶生产(15]这也会降低生产成本。通过常规诱变(紫外线或化学暴露)改善微生物菌株是众所周知的。在本研究中，采用序贯随机诱变增强蛋白酶从放线菌分离物中产生。

材料与方法

放线菌菌株的分离

从印度拉贾斯坦邦的Sambhar盐湖水域分离到一种耐盐嗜碱放线菌A1F2。在含有环己烷(50 μg/ml)、制霉菌素(25 μg/ml)和NaCl(3%)的放线菌分离琼脂(AIA)培养基中分离，28℃。

蛋白水解活性的筛选

隔离物被涂上了条纹牛奶琼脂培养基含(g/l):33.33脱脂牛奶粉末，1.18磷酸二氢钾，1.0磷酸氢二钠，1.25甘氨酸，0.66氢氧化钠，30.0氯化钠，16.67琼脂，调整到pH 8, 28℃孵育48小时，观察水解区。

表型特征

根据Bergey的确定细菌学手册中提到的标准方案，对生物体进行了鉴定和特征描述[16］．

液体分批发酵中的蛋白酶生产

培养物在250毫升的Erlenmeyer烧瓶中培养，瓶中含有100毫升由(g/1000毫升)葡萄糖30.0、硝酸钠3.0、酵母提取物4.0、硫酸镁0.5、磷酸氢二钾1.0和碳酸钙1.0组成的培养基，在震动培养箱(MAC)上以28°C、160转/分钟的速度培养48小时。在4°C冷却离心机(Sigma Sartorius 1-15 PK)中以10,000 rpm离心10分钟后收集上清。

蛋白酶试验

采用分光光度法测定粗上清液的蛋白水解活性[17］．在所使用的实验条件下，一单位酶活性定义为每分钟从酪蛋白中释放一微摩尔酪氨酸当量所需的酶量。

16srDNA测序分子鉴定

从24 h的培养物中分离DNA，用16S rDNA基因片段进行扩增聚合酶链反应使用8F和1492R引物。的正向和反向DNA测序反应聚合酶链反应扩增用BDT v3.1周期测序试剂盒在ABI 3730xl遗传分析仪上进行。利用校准软件对1414 bp 16S rDNA基因的正向和反向序列数据进行BLAST，并与NCBI genbank数据库的NR数据库进行比对。以最大识别分数为基础，采用多重比对软件Clustal w对前10个序列进行比对，利用RDP数据库生成距离矩阵，用MEGA 4构建系统进化树。

随机突变菌株改良

吖啶橙(AO)处理:将培养两天的母株接种于50 ml M1培养基中，28°C, 160 rpm，孵育48 h。将2ml培养物加入1ml AO稀释液中(10^－1μg/ml至10⁵μg / ml)。孵育90分钟后，取2 μl镀上牛奶琼脂板上。以未处理的亲本菌株为对照。在28°C下孵育48小时，观察菌落形成和水解情况。用杀灭率为99%的板根据形态变化和水解区进行突变体选择。

溴化乙锭(EtBr)处理:从AO处理中选择突变体，采用上述方法用EtBr (0.2 g/l ~ 1.5 g/l)进行诱变。以AO处理的突变体为对照。

紫外线照射:在相同条件下，将EtBr诱变后选择的突变体接种于M1培养基中24 h。培养物在4°C、5000 × g下离心10分钟。慢慢倒出上清液，用0.9%无菌低温NaCl洗涤两次，重悬于50 ml相同溶液中[18］．将10ml等份的细胞悬液转移到无菌培养皿中，在紫外线室(ACCO)中以10cm的距离用254nm的紫外线辐射照射1-4分钟。通过用铝箔包裹在黑暗中过夜，可以避免光活化。以EtBr处理的突变体为对照。辐照后的细胞悬液在5000×g离心10分钟，再悬浮于10 ml M1培养基中，28°C孵育18小时。培养物在0.9% NaCl无菌溶液中连续稀释，并涂抹牛奶在28°C下培养48小时。突变体选择过程类似于AO和EtBr处理。

从上述实验中获得突变体后，对每个突变体进行条纹标记牛奶培养48 h后，用琼脂板与亲本菌株比较水解区直径。

统计分析

蛋白酶活性以均数±标准差(SD)表示。采用单因素方差分析(ANOVA)检测亲本和突变株蛋白水解活性的差异。

结果

蛋白水解放线菌的分离、筛选及特性研究

分离的放线菌A1F2在水解过程中表现出明显的水解区牛奶琼脂培养基(图。1)．分离物被发现是革兰氏阳性，非抗酸，丝状细菌有白色的气生菌丝体。该分离物的表型特征表明它可能属于该属链霉菌属．

16srDNA测序分子鉴定

分离株A1F2同源性99%链霉菌属sp. LD48 (Gen Bank登录号:AY641538.1)，由核苷酸同源性和系统发育分析(图。2)．

AO、EtBr和紫外诱变的效果

用AO、EtBr和UV对分离物进行诱变，每一步都能观察到水解区直径的增加牛奶琼脂板(图。3)．

蛋白酶试验

序列随机突变增加蛋白酶每一步的活动(图。4）蛋白酶母株活性最低，为16.448 U/ml±0.6625 U/ml，用吖啶橙诱变后活性提高(21.912 U/ml±1.983 U/ml)，用溴化乙锭诱变后活性提高(25.049 U/ml±0.721 U/ml)，紫外诱变后活性最高，为36.230 U/ml±2.804 U/ml。经方差分析，亲本菌株和突变株的活性在1%的显著水平上存在显著差异(F=65.44)。

讨论

突变在微生物菌种改良中起着重要作用蛋白酶从而提高碱性蛋白酶的产量。几种突变技术正被用于菌株改良，以产生最大产量的酶[19］．目前的研究旨在描述一种蛋白酶从Sambhar盐湖产生放线菌，并增加其产量蛋白酶采用随机序列诱变。分离物鉴定为链霉菌。选择相对稳定、产量较高的菌株进行序列诱变蛋白酶从前一处理中分离出来的突变株，用于下一个诱变步骤。水解区直径的增加牛奶用AO、EtBr和UV诱变分离物时，观察每个步骤的琼脂板。这些突变体进一步通过摇瓶酶产研究母本分离。观察到在每个诱变步骤后蛋白酶活动亦有所增加(图。4)．在所有得到的突变体中，最大蛋白酶紫外突变体产量为36.230 U/ml±2.804 U/ml。结果表明，UV突变体是超活性突变体，约为2.2倍蛋白酶在相同培养条件下，其活性高于母株(16.448 U/ml±0.6625 U/ml)。本研究的结果与Shikha和Darmwal先前进行的研究一致[20.的研究报告显示，他们的发病率增加了1.44倍蛋白酶生产超过母系的芽孢杆菌pantotheneticus而阿扎德[21]报道，在诱变处理后，酶活性增加了数千倍芽孢杆菌隔离MA6。杜塔和班纳吉[22]也观察到碱性增加了2.5倍蛋白酶紫外突变法生产假单胞菌JNGR242 sp。从目前的研究可以得出结论，序列随机诱变改善蛋白酶结果表明，序贯诱变工艺对提高碱液产量更为有效蛋白酶与单一诱变剂治疗相比。由此获得的突变体可用于蛋白酶的大规模工业生产。

确认

作者感谢科学和技术部，拉贾斯坦邦，印度，为这项工作提供财政援助(批准no。P7 (3) DST/R&D/2008/10775)和斋浦尔IIS大学的设施和财政支持。

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