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毒性的铅在乳儿大鼠股骨骨:减轻了螺旋藻

*通信:

Gargouri米、科学教师、实验室动物生态生理学、科学教师,斯法克斯大学3038斯法克斯,突尼斯,
电话:+ 216 74 241 888;电子邮件:manele.gargouri@gmail.com

文摘

本研究旨在评估产前暴露于醋酸铅的毒性作用(Pb)对新生大鼠的骨组织和螺旋藻的有力保护作用(Arthrospira platensis)添加到饮食。雌性老鼠被给予正常饮食或饮食富含螺旋藻。此外,一半被醋酸铅通过饮用水14产后第五天的妊娠。Pb组,减少身体和股骨重量以及股骨长度幼崽。脂质过氧化增加,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活动在股骨被降低了。我们的结果也显示新生儿的主要沉积在血液和股骨。此外,铅引起的骨钙和磷含量明显下降,然而,在等离子体中,他们增加和减少反向。此外,血浆总tartrate-resistant酸性磷酸酶是增强的,虽然总碱性磷酸酶是减少。骨疾病经股骨组织学变化。相反,没有这样的赔偿或生物化学变化的形式被发现从螺旋藻喂养新生儿lead-poisoned母亲。 These results strongly suggest that beneficial effects of spirulina proceeded through the reduction of the lead-induced oxidative压力及相关损失。

关键字

骨;铅中毒;氧化应激;螺旋藻;尚未断奶的小狗

介绍

铅(Pb)是一个持续的空气污染物可以通过许多途径释放到环境主要由工业活动。找到这个元素在环境和进入人体和动物通过空气,水和食物1,2]。就被归类为致癌金属对人类及其毒性的一个主要公共健康问题,尤其是对胎儿或新生儿。先前的研究已经表明,领导,即使在低浓度和短期的暴露诱导细胞异常和死亡(3]。最重要的器官这一目标导致中毒是中央和周边神经系统,造血系统、肾脏和生殖系统(2,3]。铅毒性的重要目标之一是骨髓血液中发挥了至关重要的作用细胞生产效率是至关重要的本征函数的循环,淋巴和免疫系统(4]。此外,Aufderheide和Wittmers [5)表明,在婴儿期和儿童期、铅沉积在骨小梁,最活跃的重构。

骨是一个专门的结缔组织,形成身体的框架。各种生理条件可以影响股骨骨代谢。几种机制参与这个过程,但最重要的是氧化损伤和归纳细胞凋亡影响结果不同的细胞和分子机制包括oxidant-sensitive转录因子、脂质过氧化作用,DNA损伤,细胞信号传导通路,钙和巯基体内平衡以及毒性在DNA和核蛋白质2,6),和抗氧化剂酶的失活7]。

一个替代,以防止lead-induced氧化损害动物提供饮食富含抗氧化剂。尊重,天然产品已收到相当大的关心预防许多疾病,药物和外源性物质的毒性8- - - - - -10]。此外,天然添加剂可以导致营养需求,刺激内分泌系统和中间营养代谢11]。

螺旋藻platensis(SP),蓝微藻类(蓝藻光合作用)有许多生物活性。由于其高含量的有价值的蛋白质、氨基酸、维生素、β-胡萝卜素和其他色素,矿产(不可或缺的脂肪酸和多糖,SP发现适合作为生物活性饲料添加剂(12]。营养价值的SP已知略取决于生产系统。此外,抗炎,王亚南、神经保护和抗癌SP活动检查(11- - - - - -16]。

据我们所知,对Pb期间管理的持续影响胚胎发育的特定阶段。此外,没有研究进行描述lead-induced氧化乳儿老鼠压力和骨骼疾病在怀孕和产后时期。此外,螺旋藻在lead-induced股骨毒性的保护作用尚未研究。因此,本实验是第一次尝试评估骨生化参数、氧化压力骨骼和组织病理学变化的乳儿subchronic后大鼠的成年老鼠暴露在铅环境怀孕和哺乳期间,随后决定,螺旋藻补充的能力提高和保护骨骼的成熟和发展。

材料和方法

试剂

所有本研究中使用的试剂均为分析纯。醋酸铅(形式)是来自SD精细化学品,Bhoisar,孟买,印度。当前所有化学物质随着5,50-Dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB)和LGlutathione(简化型)从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。

植物

螺旋藻(Arthrospira platensis)各种Lenor(粉状)获得了在比利时列日大学的。

准备食物

标准饮食提供给大鼠由颗粒含有小麦、紫花苜蓿、大豆、维生素和矿物质。另外,饮食富含植物是由混合植物粉与食物颗粒在蒸馏水,以获得一个同质粘贴。混合物是切成颗粒,可以在实验开始前干燥。

初步研究中,使用不同的植物饮食中剂量(即。0%到15%,w / w),并没有透露任何毒性作用或氧化压力在成年女性接受螺旋藻剂量高达5%。高剂量导致毒性的发生,减少腹泻和增长,但不致命的老鼠(13]。

动物和治疗

Wistar鼠体重170克到180克,年龄在7至8周得到的“突尼斯中心药房”(SIPHAT)。他们被关在笼子里饲养农场的温度21°C±1°C的交替与14 h / 10 h的黑暗/照明和相对湿度约40%。所有的动物都可以免费获得饮用水。15%的蛋白质的基本食物包括工业颗粒所提供的工业社会的集中(SICO、斯法克斯、突尼斯)。

实验过程是根据生活的一般指南使用动物在科学调查乐动KENO快乐彩17)和伦理委员会批准的理学院斯法克斯。

一周后适应在实验室条件下,成年女性与男性被发情前期,精子在阴道涂片的存在日0时指出。怀孕的女性被单独安置在塑料笼子温控托儿所(22°C到24°C)。

32怀孕的老鼠16大鼠随机分为两组。第一组包括控制动物饮用蒸馏水。第二组被水含有6克/ L醋酸铅(18]。每组又分为两个子组的八个动物。动物不陶醉中铅、老鼠属于C(控制)和S(螺旋藻)子组被给予正常饮食和饮食富含5%螺旋藻。类似地,两个子组治疗醋酸铅有正常的饮食(Pb)或饮食富含螺旋藻(Pb)。第五天的所有组治疗妊娠哺乳期的第14天,发展强烈敏感环境污染物在此期间(19]。

出生时,小狗从每个母亲都重,每个垃圾减少到8幼崽(4男性和女性)为了最大化泌乳性能(20.]。在哺乳期间,水坝的水和食物摄入量每日测量在同一时间:每日摄入的饮食量计算的区别饲料放在食品箱的重量(D1),剩下的第二天(D2)。所有记录的数据被用来计算平均每日采食量在整个实验。使用这种方法,摄取大量的铅和S由每个哺乳期大坝计算从水和饮食摄入。

器官抽样

交货后14天,幼崽(控制和治疗大鼠)被腹腔注射与水合氯醛麻醉。小狗的身体重量记录和收集血液样本在肝素管臂动脉。血浆样本来自血离心后2500 x g 15分钟。他们保持在-20°C到分析。

股骨解剖了和周围肌肉和结缔组织被移除。所有样品都重。有的用于组织学检查,其他矿化服务对钙和磷的决心和其他与2毫升的均质0.1 Tris-HCl缓冲区(pH值7.2)使用杵和臼根据Ramajayam et al。21]。匀浆离心机在10000 x g为30分钟4°C和上层清液用于生化分析。

评估的主要内容

矿化作用的血,股骨内容和球团进行了在200°C凯氏管的硝酸/高氯酸(2:1 v / v)混合物。主要内容被确定使用快速连续的原子吸收光谱仪(220 FSAA,瓦里安)。因此,食品中没有检测到铅丸。钙和磷含量在等离子体和股骨测定使用离子测定乙烯diaminetetraacetic酸二钠盐溶液的pH值(EDTA)在12和1313]。

生化检测

血清碱性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)的水平:等离子体水平的总碱性磷酸酶(ALP)和总tartrate-resistant酸性磷酸酶(ACP)测定,分别由比色法(Elitech诊断认为法国裁判pasl - 0501;Biomerieux法国裁判746419901)。

蛋白质定量:骨蛋白质含量测定根据洛瑞的et al。22使用牛血清白蛋白)方法。

测定抗氧化酶活动和脂质过氧化水平:骨的脂质过氧化水平估计通过测量硫代巴比土酸的形成活性物质(TBARS)根据八木的23)方法。在骨匀浆超氧化物歧化酶(SOD)活性测定根据拜尔和Fridovich [24)方法。过氧化氢酶(CAT)活性测定采用Aebi的方法(25],谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活动是根据测量的方法Flohe和Gunzler26]。

组织学研究

其他股骨组织学研究清洗附着软组织和立即脱钙在室温下在醋酸1.7 mol / L 3天根据塔尔博特et al。27]。骨头固定在bouin解决方案。在分级在甲苯、乙醇系列和水化后骨样本嵌入石蜡。部分准备5毫升、石蜡和甲苯,脱水,沾hematoxylin-eosin [28]。然后,铅存款证明通过rhodizonate染色特点深棕色的颜色(29日]。

统计分析

使用统计软件包对数据进行分析程序统计图形+ 5.1(统计图形)。执行统计分析使用单向方差分析(方差分析)以及Fisher保护至少显著差异(FLSD)测试作为一种事后测试对比组。差异被认为是各级显著(P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001)。

结果

铅对健康状况的影响

死亡并不在任何实验观察组在治疗期间(21天)。然而,在治疗组,一些临床症状如减少活动,增加弱点被观察到。

食物摄入量

铅暴露的母亲造成的消耗减少食品(-24.8%)和饮用水(+ 30%)。螺旋藻Co-treatment食物和水消耗提高了母亲,达到正常的值(表1)。

表1:铅暴露的影响和/或螺旋藻消费母老鼠的体重。日常食品消费、水摄入量和体重控制(C)或治疗母亲6 g / L醋酸铅(Pb)和5%的螺旋藻饲料(Pb)从第五天怀孕后第14天交货。

体重,股骨重量和长度

Pb组明显降低(P < 0.01)的重量14-day-old老鼠发现安乐死一天控制男性和女性相比,分别为(表2)。

表2:体重,股骨重量和长度14天老鼠从控制(C)或治疗母亲6 g / L的醋酸铅(Pb)和5%的螺旋藻喂养(Pb),从5^th怀孕的日子,直到交付后第14天。

此外,添加螺旋藻在食品孕妇和哺乳期妇女导致高度显著增加身体重量(+ 10.6%,P < 0.05)和14天的雄性和雌性比控制。螺旋藻的补充饮食控制的母亲本身没有影响新生儿的体重(数据没有显示)。

导致政府在怀孕和哺乳期妇女导致一个高度显著降低股骨重量和长度14天男性(分别为-28.47%和-8.49%)和女性(分别为-26.41%和8.41%),而控制表2。而补充的螺旋藻的饮食控制母亲本身没有影响股骨重量和长度的新生骨(数据未显示),添加螺旋藻对大鼠饮食恢复铅影响股骨重量和长度的雄性和雌性幼崽。

治疗对新生儿血液中铅浓度的影响和骨头

血铅水平测量控制和中毒组表3。血铅浓度陶醉崽14天的8.2 - 7.5倍增加男性和女性相比,在控制,分别。添加螺旋藻的饮食控制母亲本身没有影响新生儿的血铅水平(数据没有显示)。在同一组,显著增加在领导活动中男性和女性的骨泉(分别为12和11倍)相比,控制动物。

表3:血液中的铅浓度和骨骼的14天老鼠控制(C)或治疗母亲6 g / L的醋酸铅(Pb)和5%的饲料螺旋藻(Pb),从怀孕的第五天到第14天之后交货。

此外,饮食的补充lead-intoxicated母亲螺旋藻显著减少了50% (P < 0.01),血液中铅的积累和骨骼新生儿的循环。

骨钙和磷含量,等离子体

母亲的接触Pb (6 g L¹)改变后代的骨矿物组成。的确,减少钙含量-76.5%和-38.8%男性和女性新生儿的骨骼组织,分别指出(表4)。此外,磷水平下降了-23%和-39%,男性和女性的后代的骨头,分别。此外,钙含量增加了在等离子体+ 17%和+ 18%。而在等离子体磷水平下降了-30%和-28% (表4)。的男性和女性新生儿分别与控制。添加螺旋藻的饮食控制母亲本身没有影响骨骼的钙和磷水平和血浆的新生儿(数据未显示)。

表4:骨钙和磷含量和血浆14天老鼠从控制(C)或治疗母亲6 g / L的醋酸铅(Pb)和5%的饲料螺旋藻(Pb),从5^th怀孕的日子,直到交付后第14天。

补充的螺旋藻调制明显的钙和磷水平股骨和新生儿的等离子体(表4)。

等离子体水平的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)

生化标记物如tartrate-resistant总酸性磷酸酶(ACP),这反映了骨吸收,增加了58%,60%,雄性和雌性后代的分别;虽然总碱性磷酸酶(ALP),反映骨形成,显著降低(p < 0.05) (图1)。

螺旋藻的补充纠正股骨生化标记,达到正常的价值观。

脂质过氧化作用在骨

导致中毒的母亲导致+ 14%和15% TBARS浓度的增加股骨匀浆的男性和女性新生儿,分别比消极的控制。在这里,添加螺旋藻的饮食控制母亲本身没有影响脂质过氧化水平的新生儿(数据未显示)表5)。

然而,饮食补充螺旋藻lead-poisoned母亲的股骨过氧化水平显著降低新生儿对控制水平(P < 0.05)。

在骨骼抗氧化酶活动

lead-treated股骨匀浆的老鼠,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低了-27.6%,-22%和-52%的男性后代相比,负控制(表5)。类似的观察可以在女性新生儿(分别为-30%、-25%和-54%,股骨)。

螺旋藻的管理改善酶活性(猫,GPx和SOD) (Pb + S)组。

组织学研究

上面引用的生化修改与我们的组织学研究(图2)。事实上,在股骨部分lead-treated老鼠,增殖软骨细胞形成离散列失败。此外,肥厚性软骨细胞分化和新血管形成在这一地区大大降低(图2 b)。治疗大鼠显示更少、更薄,支离破碎的骨骨小梁(图2 b)。相比对照组,增殖区(PZ)包含在列或扁平的软骨细胞集群增长轴平行;最大的增生性细胞分化形成肥厚性软骨细胞(图2一个)。此外,骨中骨小梁的主要spongium控制老鼠明显平行开发和组织增生的软骨细胞的列(图2一个)。当螺旋藻lead-treated老鼠的饮食补充(图2 c)。股骨部分部分逆转的组织学方面与对照组相比。在螺旋藻治疗组中,股骨组织学方面类似的控制(数据没有显示)。

rhodizonate染色(图3)透露的存在导致股骨的螯合物来自母亲的年轻老鼠出生陶醉铅(Pb组)(图3 b)。虽然这些螯合物缺席在控制大鼠(图3一)。添加螺旋藻lead-intoxicated母亲的饮食导致强烈的铅的密度减少存款的老鼠相比,股骨Pb组(图3 c)。

讨论

许多研究表明,铅暴露引发广泛的生化和生理功能障碍在人类和实验动物(30.]。更准确地说,怀孕,婴幼儿大多受到铅污染的影响(31日]。雌性老鼠在我们的实验研究,接触Pb怀孕和产后期间养育幼仔的体重下降。这可以解释为减少哺乳期大鼠的食物摄入量。对于人类来说,怀孕的女士可以将她的身体的负担,导致胎儿越来越大,由于没有胎盘屏障的重金属如铅(32]。因此,孩子从成人怀孕期间暴露于铅出生时血铅水平升高,甚至高于大坝同时采样点(32,33]。在我们的研究中,我们发现高水平的铅(超过1.5 mg / L)年轻大鼠血液和胃里的内容。一般来说,母亲和胎儿可以被认为是一个独特的系统,通过怀孕仍处于平衡状态。因此,怀孕结束时,类似的铅在体内积累缓慢,甚至低剂量可以最终导致产生各种毒性作用。,disturbances of the central nervous system, bones and soft tissues of both the mother and the child [34,35]。据我们所知,这是第一个报告,调查铅的毒性作用在骨骼成熟,矿物成分和histoarchitecture乳儿老鼠。

暴露大鼠妊娠和产后期间领导减少幼崽的股骨重量和长度。似乎超过90%的Pb最终存储在骨(36]。事实上,Pascaul et al。37]表明,骨基质是一种组织高代谢活动,已经报道这种类型的观察和一些污染物可以破坏它的形成,导致骨生成缺陷从而影响骨的长度和质量。我们的结果也显示显著积累铅比控制(超过500%)的年轻大鼠骨治疗水坝,和骨头的矿物组成的变化,尤其是钙和磷。这些数据符合最近的研究在老鼠和人类进行的,这表明,污染物影响骨骼强度,导致骨组织构成的变化(38,39]。此外,我们的研究表明,在血浆钙含量增加,矛盾的是,磷水平下降,这也反映出了一个改变骨矿物成分,尤其是减少钙和磷的内容。这可能是解释说,根据Arai et al。40),由氧化压力这可能影响骨矿化。

骨形成和不断再吸收,从胚胎和持续的整个成年生活。这个过程发生在成人骨被称为骨重塑,这是由成骨细胞成骨细胞和破骨细胞骨吸收细胞。在目前的调查,生化标记如tartrate-resistant总酸性磷酸酶(ACP),这反映了骨吸收,增加,而总碱性磷酸酶(ALP),这反映了骨形成,减少幼崽的铅治疗组相比,控制。随着骨吸收增强,骨质流失的量在不断发生吸收不完全恢复期间形成,导致骨质疏松。我们同意先前的研究结果,发现其他金属如锂、铬和铀抑制骨形成(41- - - - - -43]。其他研究已经表明,活性氧参与骨吸收与骨osteoclast-generated的直接贡献超氧化物降解[44- - - - - -45]。因此,氧化压力增加破骨细胞的分化和功能(46]。在这方面,杨et al。44]表明成骨细胞可以产生抗氧化剂如谷胱甘肽过氧化物酶保护细胞免受活性氧,同时osteoclast-generated超氧化物有助于骨骼退化。记住所有这些可能性在骨吸收、骨形成的障碍在我们的研究中观察到可能是由于ROS生成后导致中毒。

在骨形成障碍,反映在其矿化和周转率的变化,是与组织学研究。事实上,生长板在lead-treated老鼠相比严重紊乱的控制。Pb-treated老鼠,增生的软骨细胞没有形成离散列和肥厚性区明显是发达国家和形态截然不同。此外,骨中骨小梁的主要spongium控制老鼠组织平行于软骨细胞泛滥的列中,反映出功能连续性之间成熟软骨细胞和成骨细胞矿化所需的正常软骨内骨化,同时,在处理老鼠,我们观察到一些,薄、支离破碎的和混乱骨骨小梁相对于控制。

值得注意,我们的数据表明,期间,母老鼠食用螺旋藻铅治疗预防Pb对新生儿的不良影响骨骼和等离子体。螺旋藻被认为是一个有价值的一些宏观的食物来源微量元素包括高质量的蛋白质,铁,γ-linolenic酸、类胡萝卜素、藻青蛋白维生素(47,48]。此外,维生素D被发现防止骨质疏松,骨折,老年人休息。维生素D调节骨代谢和已知发挥重要作用在增强骨骼的钙和磷的吸收(49]。同样,变形和功能障碍的关键细胞在骨建模和重建损伤经常与维生素A缺乏症,管理类维生素A在骨骼中扮演着重要部分生物学在动物50]。因此,螺旋藻消费的好处在新生儿母亲大鼠股骨发展可能是由于维生素补充的后代。

一般来说,氧化压力是一个常数威胁所有生物体和身体吗消除或衰减雇佣一个内源性抗氧化防御系统(51]。在最近的研究中,我们的研究结果证实一代氧化压力在乳儿大鼠的股骨。我们的数据表明,中毒铅引起的脂质过氧化作用显著增加大鼠的骨。脂质过氧化反应是氧化损伤的主要表现之一,扮演着一个重要的角色在许多的毒性外源性物质(52]。我们的结果证实了我们之前的结果(13,14和Soudani et al。43]报告增加骨的TBARS乳儿幼崽处理铬。

螺旋藻的合并施打Pb-treated组MDA水平恢复至接近正常的价值观。这可以解释为螺旋藻的重要作用在防止脂质过氧化和保护组织的完整性和功能细胞(53]。在这一点上,螺旋藻据报道拥有重要的初级水平抗氧化剂包括维生素C;它是一个抗应激和一个强大的还原剂。它有助于激活几个酶和充当解毒有毒物质(一种抗氧化剂54),它可以保护血浆脂质与脂质过氧化和α-tocopherol的再生有重要作用(55]。

几项研究已经表明,铅,与氧化有关压力与细胞损伤的后果是增加生产的自由基和抗氧化防御系统的能力降低13,14,43]。自由基的生产被认为是诱导骨疾病通过抑制骨形成,刺激骨吸收。的确,抗氧化剂缺乏对骨量(有一个负面影响21]。所以,有越来越多的证据表明,氧化压力有助于骨骼损害,而抗氧化剂可能防止多余的活性氧引起的氧化损伤物种在骨组织中(56]。在目前的研究中,老鼠暴露在铅环境独自怀孕和产后期间降低了酶促抗氧化成分如过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)。这些酶的损耗负责的缺乏可能是一个因素消除有毒化合物进入骨头,导致积累,从而加重氧化应激。

值得注意,SOD, CAT和GPx活性在新生儿股骨被哺乳期妇女食用螺旋藻后改善。事实上,螺旋藻是富含维生素c。事实上,先前的研究Padh [57)表明,维生素C的主要作用是中和自由基的细胞内外。根据作者,维生素C是一个很好的电子,可以捐赠给如羟基自由基和超氧化物自由基和熄灭他们的反应。此外,维生素C含量股骨组织主要由于重要性的主要作用下抗氧化保护骨形成慢性博览会。

结论

这是第一个报告表明,铅会导致氧化损伤乳儿大鼠的骨组织。合并施打螺旋藻通过饮食改善Pb-induced osteomineral代谢的变化,骨骼histo-architecture酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)的活动。因此,螺旋藻可以是一个有用的方法来防止骨损伤。Sp补充的保护作用可以涉及Sp的功能激活和保护各种Sp-dependent酶。

确认

目前的工作是由DGRST格兰特(方向兴业银行de la任职et Technique-Tunisie支援大学医疗de la生僻基地UR / 13 es - 73)。作者还要感谢Xavier Dauvergne博士对他的帮助的统计分析数据。

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