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年龄的种子对水稻的影响转换与干旱胁迫诱导转录因子编码基因即peg法gydF4y2Ba

Ibandalin M,克什瓦和阿鲁娜TgydF4y2Ba^*gydF4y2Ba

生物化学,印度农业研究所,印度gydF4y2Ba

*通信:gydF4y2Ba

一边抚摸TgydF4y2Ba生物化学,印度农业研究所,110012年印度新德里gydF4y2Ba电子邮件:gydF4y2Ba (电子邮件保护)gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

胚胎发生的愈伤组织体外生产的脱壳成熟的种子gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba轰炸了一个包含干旱诱导转录因子的基因构造编码基因命名为AP2 / ERF-N22驱动下诱导启动子RD29A使用即peg法。潮霉素的轰炸老茧选择包含选择的媒介。转换效率是nil,每年为overstored种子≥0.97%和3.11%,分别为≤1年和新鲜的种子。植物的存活率是87%。约90%的植物达到成熟,没有负面的表型影响或畸变,观察在早些时候从野生型的组成型启动子。gydF4y2Ba

关键字gydF4y2Ba

愈伤组织;水稻;成熟的种子;转换;轰炸;基因转移;再生;AP2 /小块土地gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

水稻是世界上最重要的农作物之一,满足粮食需求超过一半的世界人口。然而,gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba盐度和水压力相对敏感。为了适应和成长在不同的环境中,植物已经开发出一种复杂的信号网络。在分子水平上,各种转录因子(TFs)调节多个表达式gydF4y2Ba压力gydF4y2Ba响应基因(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。在过去的几年里各种转录因子在植物特征的角色gydF4y2Ba压力gydF4y2Ba响应。在不同的TFs, AP2 / ethylene-responsive元件结合蛋白(AP2 / EREBP)gydF4y2Ba家庭gydF4y2Ba扮演着一个重要的角色在不同的规定植物生长等生物过程,发展,和响应非生物压力(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

了解监管网络和耐旱机制,研究人员正在操纵这些基因在转基因植物的活动改善压力条件下作物产量。文献研究表明,超表达下对植物组成型启动子可能负面影响(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。早期的研究差异表达的AP2 / ERF-N22耐旱gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Basp籼稻简历N22 [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),当过表达gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在组成型启动子,引起表型畸变虽然改进抗旱能力相比WT (gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

植物从胚胎提取水稻愈伤组织再生,首次报道了Nishi et al。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。自那时以来,许多方法使用各种原生质体等外植体,未成熟种子和胚胎发生的组织已报告的效率gydF4y2Ba基因表达gydF4y2Ba在gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。通用电气等。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)成功标准gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba通过使用另一个外植体转换。除了探索不同外植体的使用,研究者们研究了各种影响因素和影响转化效率。拉梅什和古普塔(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)显示,孵化时间的愈伤组织轰炸之前大大影响了效率。李等人。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]报道大幅提高转化效率耐轰炸后去掉了老茧,随后子培养在再生和植物生长。Mandal et al。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)表明,愈伤组织的大小和年龄之前轰炸影响大米的转换率。Jadhav et al。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)调查的效率转换基于类型的愈伤组织诱导培养基。干燥部分愈伤组织轰炸之前和之后影响拍摄和芽开始并最终non-desiccated老茧无论再生效率gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba基因型(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。种子的年龄从来没有认真考虑的因素之一,影响转换。无论多么良好的存储条件可能种子随时间的可行性。gydF4y2Ba

考虑到这一点,我们改变了gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba使用gydF4y2BaAP2 /小块土地gydF4y2Ba家庭gydF4y2Ba转录因子即peg法variety-independent,高效和简单,还研究了年龄的种子对转化效率的影响。此外,过度的gydF4y2Ba美联社/ ERF-N22gydF4y2Ba在gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba拍摄下干旱诱导启动子RD29A在这项研究是否负表型观察拟南芥在早些时候组成型启动子可以纠正gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

设计的构造gydF4y2Ba加入AP2 / ERF-N22(没有。EF362638)驱动下CaMV35S启动子和Nos终结者是限制从二进制构建pBI121: CaMV35S-AP2-Nos (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba在pCambia1200)和克隆。重组构建命名为pC1200: CaMV35S-AP2-Nos (gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)是限制移除CaMV35S,取而代之的是诱导RD29A发起人获得重组二进制的构造,现在命名为pC1200: RD29A-AP2-Nos (gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

媒体和文化条件gydF4y2Ba

培养基用于这些实验调整与氢氧化钠pH值5.8。愈伤组织诱导培养基(CIM)由女士(Murashige和斯库)和蔗糖粉30 g / l,酪蛋白水解物200 mg / l,脯氨酸500 mg / l, 2,4 - d(1毫克/毫升)2毫升/ l和2.5 g / l phytagel。渗透媒体除了CIM包括山梨糖醇0.2 M和manitol 0.2 M .潮霉素选择媒体除了CIM由50 mg / l潮霉素。再生媒体除了CIM由300 mg / l谷氨酸,6 benzylaminopurine (BAP) 2.5毫升/ l,αnapthalene乙酸(NAA)(1毫克/毫升)0.75 ml / l, gelrite(代替Phytagel) 3 g / l和潮霉素(50 mg / l)。固体支持媒体组成的女士粉2.2 g / l,蔗糖15 g / l, FeSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba2.5毫升,gelrite 3 g / l。液体一样支持媒体组合是固体媒体除了gelrite加油。gydF4y2Ba

实验植物组织gydF4y2Ba

脱壳成熟种子(200 - 500)的天sugandh 2表面消毒、接种到CIM (gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba为1 - 2周)28°C下完全黑暗。结节状结构出现的区域角质鳞片。愈伤组织与胚乳分离,切成小块,并安排在团渗透介质板所示gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba。轰炸之前,这些小的老茧在28°C下孵化完全黑暗4 h后老茧受到黄金粒子轰击。经过48小时的潜伏期在黑暗28°C,每个愈伤组织转移到选择媒体含有潮霉素(50 mg / l), (gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba和gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba)和孵化28°C下完全黑暗。15天之后,幸存的老茧转移到新鲜的选择媒体。快速扩散的老茧体细胞胚胎的形式显示白色细粒度的行业。一些部分坏死(布朗领域)和、老茧也观察到,在每个亚文化被移除。转移的时候,个人愈伤组织胚胎或愈伤组织块被使用钳成几个小块,分别维护。在接下来的两到三选择段落,愈伤组织块显示的证据更有力的增长被转移到新的选择。所有发达来自每一块胚愈伤组织或愈伤组织定义为一行。有许多植株获得每个愈伤组织定义为一条直线。gydF4y2Ba

Microprojectile轰炸gydF4y2Ba

所有轰炸进行即peg生物Rad pds - 1000 / HeTM系统。30毫克的黄金粒子(0.6μm)和无水酒精清洗三次。50μl 2.5 CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,20μl 0.1亚精胺和10个质粒pC1200μl: RD29A-AP2-Nos(1μg /毫升)被添加到黄金暂停10μl,其次是2分钟孵化的冰,和短的自旋在10000 rpm。颗粒悬浮在90年μl乙醇,其中12μl均匀散布在宏观载体(猫# 1652335,生物Rad,印度)。每一个实验是轰炸在1100 psi的压力。的距离阻止板的目标是保持9厘米破裂盘(猫# 1652329,生物Rad)。gydF4y2Ba

分子分析gydF4y2Ba

DNA分离采用CTAB法(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。分析转基因植株,非常少量的叶(叶)的一部分样本每一行是用无菌钳的帮助。通过使用微杵DNA分离。然而,对于成年成熟植物的分子分析,500毫克的叶组织。总RNA为WT孤立,转基因植物控制和改进。改进算法是由扣缴水从转基因学了三天。互补脱氧核糖核酸的合成。证实了基因的集成PCR,印迹分析和qRT PCR。为gydF4y2Ba聚合酶链反应gydF4y2Ba分析特定的引物RD29A、hpt基因和AP2 /小块土地- N22。gydF4y2Ba聚合酶链反应gydF4y2Ba产品的启动子和AP2 / ERF-N22用作杂交探针的屁股。5μg DNA与EcoRI消化。EcoRI网站内部RD29A内的基因和缺席。探针标记使用了DecaLabel™标识工具包(Fermentas、印度)gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP标记ATP。标记的探针是根据制造商的协议。gydF4y2Ba

结果和讨论gydF4y2Ba

设计构造的转换gydF4y2Ba

二进制构建pBI121: CaMV35S-AP2-Nos (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)携带基因AP2 / ERF-N22 (Acccession没有。EF362638)驱动下CaMV35S启动子和含卡那霉素选择标记基因用于早在我们的实验室gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)是不习惯gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba转换,因为两个原因即存在本构CaMV35S(发起人)和卡那霉素选择标记基因。构建pBI121: Nos.AP2。CaMV35S (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba),携带着基因AP2 / ERF-N22驱动下CaMV35S启动子和卡那霉素作为选择标记限制EcoRI和HindIII释放2.1 kb(的棺材gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)包含CaMV35S(子),(AP2 / ERF-N22)和Nos终结者。同时,pCambia1200: RD29A EcoRI和HindIII限制,提供兼容的网站结扎。发布2.1 kb的片段是结扎限制pCambia1200: RD29A。被任命为获得的重组构建pC1200: Nos.AP2。CaMV35S (gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)。证实了基因的存在gydF4y2Ba聚合酶链反应gydF4y2Ba和限制的分析。获得了964个基点的扩增子大小,对应AP2 / ERF-N22 (gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)。进一步证实了通过限制构造pC1200: Nos.AP2。CaMV35S不同限制性内切酶所示(gydF4y2Ba图1 egydF4y2Ba)。重组pC1200: Nos.AP2。CaMV35S限制EcoRI和BamHI释放的一个片段1.2 kb含AP2 /小块土地-N22gene +号后(5巷1 e)和通过限制HindIII和EcoRI释放的一个片段包含基因启动子(CaMV35S) + 2.1 kb (AP2 /小块土地- N22gene) +终结者(NOS)后(7巷1 e)。pC1200: Nos.AP2。CaMV35S限制后III和BamHI去除CaMV35S启动子(巷3gydF4y2Ba图1 egydF4y2Ba)。RD29A来自pCambia1200: RD29A通过限制使用相同的酶HindIII和BamHI(巷2gydF4y2Ba图1 egydF4y2Ba结扎)生成兼容的网站。片段RD29A结扎的限制pC1200: Nos.AP2。CaMV35S,现在缺乏CaMV35S启动子。二进制构建DNA重组,现在命名为pC1200: Nos.AP2。rd29 (gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba)确认gydF4y2Ba聚合酶链反应gydF4y2Ba使用基因特定引物如下。gydF4y2Ba

TCG AP2 / ERF-N22向前5 ' ATG GGA CAG亚美大陆煤层气有限公司亚美大陆煤层气有限公司gydF4y2Ba

AP2 / ERF-N22反向5 '柠檬酸手枪广汽GAG GCT ACgydF4y2Ba

预期扩增子大小为964 bp获得相应的AP2 / ERF-N22(巷2gydF4y2Ba图1 ggydF4y2Ba)gydF4y2Ba

存在inducble发起人RD29A证实了使用子特定的引物gydF4y2Ba

RD29A向前5 ' ATT注册会计师ATG AGA gg ATG TCgydF4y2Ba

RD29A反向5 ' CCC TTT ATT的有条件现金援助得到猫TGgydF4y2Ba

从内部地区作为引物设计预期扩增子的大小(巷4获得了450个基点gydF4y2Ba图1 ggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

RD29A(向前)和AP2 / ERF-N22(反向)引物被用来确认定位基因的启动子,使用以下引物gydF4y2Ba

RD29A向前5 ATT CGA ATG AGA gg ATG TC3的gydF4y2Ba

AP2 /小块土地逆转5 '柠檬酸CAC GCA棉酚ATC CAC CTC CC 3 'gydF4y2Ba

获得了预期扩增子1 kb大小(巷3gydF4y2Ba图1 ggydF4y2Ba)。编译该基因被克隆的方向和组成型启动子驱动。gydF4y2Ba

构造进一步证实了限制消化HindIII和BamHI版本所需的片段~ 1 kb的包含970个基点(RD29A) (gydF4y2Ba图1 hgydF4y2Ba)。最后构建pC1200名义:Nos.AP2。rd29A进一步证实了测序。gydF4y2Ba

为gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba转换研究中,潮霉素选择优于卡那霉素,据报道,protoplast-derived愈伤组织选择在卡那霉素是非常低效的再生,而大量的白化植物来自这样的实验(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。潮霉素比卡那霉素转换,因为更有效gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba显示自然抗卡那霉素(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。亦潮霉素抑制再生,也不影响gydF4y2Ba生育能力gydF4y2Ba转化株的gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。抗潮霉素hpt,因此被用来作为标记基因在转化株的选择由农杆菌介导和粒子轰击过程(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。因此,二进制向量pCambia1200 hpt基因是在这项研究中。gydF4y2Ba

影响时代的种子gydF4y2Ba

许多研究已经完成确定合适的外植体gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba愈伤组织诱导。等外植体成熟和不成熟的胚胎gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),叶片(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),成熟种子(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),小孢子和花药gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),根gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba和胚芽鞘gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)已经使用资源gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba胚胎发生的愈伤组织生产。胚胎发生的老茧高需要高效的再生能力gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba转换。虽然不成熟的组织,含有大量分生gydF4y2Ba细胞gydF4y2Ba更适合生产的胚胎发生的愈伤组织与成熟的种子,特别是对于顽固的基因型,但大规模制备不成熟的胚胎是乏味的和有季节性的局限性gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。然而,成熟种子有方便的可存储性和可用性的优势。进一步使用成熟的种子gydF4y2Ba协议gydF4y2Ba为gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba转换效率和简单容易生产改进的基因型的遗传工程与基因功能研究的潜力。gydF4y2Ba

这是观察到的种子(外植体)的存储很长一段时间显示延迟愈伤组织的形成,或根本没有愈伤组织的形成,而一些显示延迟再生或没有再生(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。然而,当新鲜种子(1 - 2周后收获)既没有延迟用于愈伤组织形成,也在再生(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。进一步,观察到新鲜种子引发了健康的愈伤组织,与再生开始显示最初的绿化,在一段时间的一个月(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)。这些都被转移到瓶子,让他们进一步再生。4周后转移到再生培养基和孵化下光周期(16 h光/ 8 h黑暗)房间里增长25°C,迅速体细胞胚胎再生与小根(shootletsgydF4y2Ba图2 fgydF4y2Ba)。每个植株分离和转移到固体支持媒体增强根系生长。后一个星期左右,充分发展的主要和次要的根,然后将每个植株转移到液体媒体加油导致发展正常的根(gydF4y2Ba图2 ggydF4y2Ba)。每个植株证实转基因转移到小锅含有soilrite和使用透明塑料袋适应植物覆盖。允许空气交换,小洞在塑料袋(gydF4y2Ba图2 hgydF4y2Ba)。7 - 12天之后,塑料袋被移除和植株转移到锅和允许在温室成长到成熟(gydF4y2Ba图2我gydF4y2Ba)。本研究表明,愈伤组织形成的能力在很大程度上是依赖于种子的年龄反过来是高效的先决条件gydF4y2Ba大米gydF4y2Ba转换。gydF4y2Ba