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，卷:17(2)

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花生中黄曲霉毒素B1, B2, G1和G2的分析:验证研究

*通信:

Gurav NP国立化学系农业以及印度浦那斯瓦盖特食品分析研究所，电话:+ 91-020-24440079;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

黄曲霉毒素是由黄曲霉、寄生曲霉和黑曲霉产生的有毒致癌次级代谢产物物种真菌。因此，食品和饲料中黄曲霉毒素浓度的检测非常重要。建立了高效薄层色谱分析方法，并对其进行了验证协议关于黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2测定的线性度，灵敏度，精密度，LOD, LOQ和准确性的分析程序验证:方法学，国际协调合作(ICH)。色谱法在薄层上进行了实验色谱法(TLC)。薄层色谱板预涂E-Merck硅胶60 F254 0.25 mm厚，铝板由Camag Linomat-5涂抹器，流动相条件丙酮:氯仿(1:9)。用HPTLC法测定花生样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。黄曲霉毒素采用AOAC法提取，TLC筛选，HPTLC定量，参比标准物为B1、B2、G1、G2。黄曲霉毒素含量均为B1(6.48、6.30、6.60)、B2(2.61、2.42、2.69)、G1(6.06、6.30、6.17)、G2(2.26、2.31、2.47)ppb，回收率分别为B1(91.98、89.51、93.73)、B2(105.2、97.53、108.50)、G1(84.12、87.45、85.72)、G2(88.42、90.09、96.62)。该方法简便、快速、专属性强，可用于花生中黄曲霉毒素含量的质、量监测。

关键字

效果;黄曲霉毒素;分离;色谱方法;验证

简介

黄曲霉毒素是自然发生的真菌毒素，由黄曲霉，寄生曲霉而且曲霉属真菌nomius，物种真菌[1］．四大天然已知黄曲霉毒素由曲霉产生物种其中“B”和“G”是指薄层色谱板在366 nm汞灯下观察到的蓝色和绿色荧光，下标数字1和2分别表示主要化合物和次要化合物[2］．黄曲霉毒素污染食品的问题，是世界上热带及亚热带地区普遍存在的问题[3.］．恶劣的耕作方式和潮湿的环境条件有利于真菌的生长。世界健康世界卫生组织将AFB1列为一级致癌物[4］．

黄曲霉毒素可能存在于广泛的食品中，特别是谷物、油籽、香料和树坚果，如玉米、花生、开心果、辣椒、黑胡椒、干果和无花果等。它也在牛奶而且牛奶产品(5］．

黄曲霉毒素含量最高的地区通常出现在气候变化很大的温暖地区[6］．重要的是要认识到，虽然黄曲霉毒素通常是由霉菌生长污染的初级食品，但这些毒素是非常稳定的，并可能经过相当严重的过程。由于这个原因，它们在加工食品中会成为一个问题，如花生酱[7］．

在足够高的接触水平下，黄曲霉毒素可对哺乳动物、鸟类和鱼类以及人类造成急性毒性，并可能导致死亡[8］．肝脏是受影响的主要器官，但在个人的肺、肾脏、大脑和心脏中也发现了高水平的黄曲霉毒素。从食品安全的角度来看，慢性毒性可能更重要，当然在世界上更发达的地区。黄曲霉毒素B1是一种非常强效的致癌物和许多动物的诱变剂，因此对人类也有潜在的影响，而肝脏又是主要的靶器官。摄入低长期以来，这一水平与原发性肝癌、慢性肝炎、黄疸、肝硬化和营养物质转化受损有关[9］．黄曲霉毒素也可能在其他疾病中发挥作用，如雷氏综合症和夸希奥科症(一种与营养不良有关的儿童疾病)[10，11］．黄曲霉毒素G1和M1的慢性毒性尚不清楚，但它们也被认为是致癌物，尽管可能比B1的致癌物要弱一些[12］．

黄曲霉毒素是相当稳定的化合物，在相对较高的温度下仍能存活，降解很少[13］．黄曲霉毒素的热稳定性受其他因素影响，例如湿度水平和pH值，但加热或烹饪过程不能破坏黄曲霉毒素，因为它也破坏了必需的营养物质[14］．

材料与方法

化学品和试剂

所有使用的化学品和溶剂都是分析级的。黄曲霉毒素混合物(B1, B2, G1和G2)采购自Sigma Aldrich。

分析样品均购自当地市场。

抽样

霉菌和黄曲霉毒素以极不均匀的方式出现在饲料和食品中。因此，取样的方式必须确保分析样品是货物的真正代表。不这样做可能会使后续的分析失效。因此，他们小心翼翼地获取了一份尽可能能代表整个散装谷物的样品。

样品制备

目的是最大限度地降低颗粒尺寸和充分混合，以实现污染部分的有效分布。在分样器中，将整批样品通过锤锤依次通过14号筛子进行分样。重新研磨1公斤的部分，完全通过20号筛和充分混合。称量50克样品用于黄曲霉毒素估算。

方法

采用AOAC方法，经薄层色谱和HPTLC，并以参考标准物定量。

黄曲霉毒素的提取

样品的分析是通过将已知数量(50 g)的粉状样品称量到500 ml烧瓶中，并用25 ml水、25 g Celite 545和250 ml氯仿处理。然后将该混合物声波处理30分钟，并频繁搅拌。然后用Whatman纸(1号)过滤。收集第二部分50毫升氯仿滤液。将玻璃棉球松散地放在底部，准备22毫米× 300毫米的玻璃柱。加入5克无水Na₂所以₄为硅胶提供基底，并加入CHCl_3.直到管半满，然后加入10克硅胶(60-120目之前在105°C干燥1小时，并加入1毫升/100克，混合均匀，保持紧密关闭约15小时)慢慢在柱中。注意柱内不能有空隙。为此，在烧杯中取硅胶，加入氯仿，不断搅拌，制备浆液。慢慢加入20毫升氯仿，然后加入15克无水钠₂所以₄，将氯仿从色谱柱排至Na上方仅1厘米处₂所以₄层。将50 ml氯仿滤液(样品提取物)加入柱中，以最大流速用150 ml己烷和150 ml乙醚洗涤，并丢弃此洗涤。用150毫升甲醇:氯仿(3:97)洗脱黄曲霉毒素，从加入时间开始收集这部分，直到流动停止。将甲醇-氯仿层在蒸汽浴中蒸发至接近干燥，将残渣转移到含有5 ml氯仿的试管中，在温和的氮气蒸汽下蒸发至干燥并保存。

将残留物溶解于0.5 ml苯:乙腈(98:2)中，用于薄层色谱分析。

HPTLC检查黄曲霉毒素

板材料:采用预涂硅胶60 F254 0.25 mm厚，E-Merck 10 × 10 cm和20 × 10 cm薄层色谱板进行研究。用流动相预洗板。

示例应用程序:使用CAMAG样品涂抹仪Linomat-5将样品以条带形式(通过喷涂技术)与标准样品一起涂抹。

流动相的制备和开发

由于双重开发可较好地解决标准问题，第一流动相采用无水醚。将20ml无水醚倒入20cm × 10cm的双槽室中，让其从TLC板下缘显影至8cm处。在暗室中蒸发乙醚使平板晾干。

用氯仿:丙酮(9:1)v/v作为流动相，在双槽室饱和后，将上述平板在同一方向再次显影。

干燥

因为黄曲霉毒素是热敏和光敏的化合物，所以要在空气中干燥。

扫描

将平板安装在CAMAG-TLC扫描仪-3的工作台上。在366 nm波长扫描板，以确定样品中黄曲霉毒素的水平。黄曲霉毒素的检测是基于它们的荧光性质。

结果与讨论

HPTLC方法开发

对于HPTLC分析，首先采用不同的固定相、流动相和溶剂室饱和时间进行了几次初步试验，试图获得黄曲霉毒素的最佳分离和分辨率。以氯甲烷:丙酮(9:1)v/v为流动相，采用双重显影法，在硅胶为固定相时，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2在Rf值为0.80、0.67、0.59和0.48±0.02时均有较好的分离峰。黄曲霉毒素标准色谱图见图1．方法验证参数和结果见表1．

表1。方法采用所提出的HPTLC方法对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2参数进行验证。

验证

方法验证是验证一个过程产生可接受的结果的过程。根据ICH指南使用以下参数对所开发的分析方法进行了验证:乐动KENO快乐彩

特异性:特异性是指在可能存在的成分中明确评估分析物的能力。以目标化合物的纯度评价了方法的特异性。所建立的HPTLC方法具有特异性，无黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准峰与其他峰的干扰，如图2．通过记录图像并在366 nm处进行扫描，如图2所示，确定被污染样品中存在黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。所有样品均含有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的峰值出现在同一Rf，其中标准黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的峰值出现在同一Rf。

从左至右:带1和带2:流动相[丙酮:氯仿(1:9)]，1

类别3及4:残渣溶解溶剂[苯:乙腈(98:2)]

5、6级:黄曲霉毒素混合标准(B1、B2、G1、G2)。

线性和范围:分析过程的线性是指其(在给定范围内)获得与样品中分析物浓度(量)成正比的测试结果的能力。根据峰高和施药浓度的响应，选择B1 (0.88 ng-8.80 ng)、B2 (0.31 ng-3.10 ng)、G1 (0.99 ng-9.90 ng)和G2 (0.32 ng-3.20 ng)为线性范围。每次分析都重复三次，并生成线性参数。线性度的三维图像如图所示图3．对样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量进行分析，结果曲线图见图4，4 b，4摄氏度而且图4 d．

准确性:准确度是指常规的真实值或公认的参考值与发现值之间的接近程度。采用标准添加法测定方法的准确度[15］．将预分析样品(花生)按已知量的标准黄曲霉毒素按浓度递增加标，显影后测定板上黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的回收率，如图所示表2．

表2。花生抽穗后黄曲霉毒素含量分析。

精度:分析方法的精度是指在规定条件下对同一均匀样品进行多次采样所得到的一系列测量值之间的一致程度(散射度)。日间精密度CV在0.51% ~ 1.02%之间。通过估算1周内5个不同日的相应CV值来确定该方法的日间精度。方法的CV值在0.71% ~ 1.16%之间。

可重复性:可重复性是指在同一实验室，由同一操作人员，在短时间间隔内，对相同的测试材料，用同一方法获得的相互独立的测试结果之间的一致性。在每次扫描过程中，我们得到了分析物峰值高度的相似值，这表明了该方法的可重复性。

检测定量限:检测极限(LOD)是测量值大于与之相关的不确定度的点。它是样品中可以检测到但不一定定量的分析物的最低浓度，而单个分析程序的定量限度(LOQ)可以被称为样品中分析物的最低量，可以以适当的精度和准确性定量确定。计算黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的LOD和LOQ值，分别为0.5 ppb和2.5 ppb，表明该方法具有良好的灵敏度。

结论

本文探讨了用HPTLC检测花生中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的新方法。进一步尝试了HPTLC对样品中B1、B2、G1、G2黄曲霉毒素含量的检测水平。结果表明，该方法简便、快速、经济、专属性强，可用于食品样品中B1、B2、G1、G2黄曲霉毒素的质、量常规分析。

确认

作者感谢国家图书馆主任维奈·奥斯瓦尔先生农业和食品分析研究所(NAFARI)，马哈拉施特拉邦浦那- 411042，为开展研究工作提供了优秀的设施。

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