原文
,卷:11(3)
米曲霉生物转化黄芩苷中碳氮源的优化
收到:2017年6月24日;接受:2017年6月29日;发表:2017年7月3日
引用:何敏,陈伟,田玲,等。黄芩苷生物转化培养基中碳氮源的优化米曲霉.生物化学学报,2017;11(3):117
摘要
黄芩苷是黄芩中重要的有效成分,具有广泛的药理活性,已被广泛应用于大多数药物中,但其不易被人体吸收。黄芩苷元黄芩苷具有较好的药理作用和较高的生物利用度,但含量较低。本研究以米曲霉为生物转化微生物。然后对黄芩苷进行生物转化,并对生物转化介质中的碳源和氮源进行优化。总体而言,米曲霉生物转化黄芩苷的最佳培养基优化为0.0017%精氨酸、0.0017%缬氨酸、0.0017%谷氨酸、0.0017%丙氨酸、0.0017%组氨酸、0.0017%酪氨酸与0.01%尿素、0.4% KH2PO4、0.04% CaCl2、0.04% MgSO4、pH为6的组合,生物转化效率为88.36%。与以玉米芯、麸皮、葡萄糖、可溶性淀粉为碳源相比,除底物黄芩苷外无碳源时黄芩苷的生物转化效果显著更好。最佳氮源为0.01%尿素与6种氨基酸的组合。综合考虑生物转化效率和成本,0.1%尿素也是米曲霉生物转化黄芩苷的良好无机氮源。
关键字
黄芩苷;生物转化媒体;曲霉属真菌aryzae;β葡糖苷酶
简介
作为一种中药,黄芩由于其根部具有较高的生物活性,在中国得到了广泛的应用。黄芩苷及其苷元黄芩苷是黄芩的主要活性成分黄芩,具有抗炎、抗病毒、抗变态、退热、保肝等多种药理活性。[1-6].相对而言,黄芩苷含量较高黄芩但很难被人体消化道吸收。苷元黄芩素含量较低,但具有较好的药理作用和较高的生物利用度[4-9].因此,有必要将黄芩苷转化为黄芩苷,以提高黄芩苷的药理活性和生物利用度黄芩.
黄芩苷可通过生物、化学和物理方法转化为黄芩素。与化学和物理方法相比,生物转化是一种酶催化过程,反应条件温和,操作简单,有效性和选择性强,对环境友好。微生物生物转化已经有许多成功的例子。芦丁可被真菌生物转化(链霉菌属将而且黑曲霉),转换效率为54% [10,11].微生物转化青蒿素也是由藻类实现的吗Cunninghamella echinulata和真菌黑曲霉[12].一些微生物(真菌、细菌、酵母)可将柠檬烯转化为其他化合物[13,14].黄芩苷和黄芩素均从黄芩这种转变过程被认为是伴随着水解反应[15].β-葡萄糖醛酸酶被认为是黄芩苷微生物转化过程中最重要的酶。β-葡萄糖醛酸酶在细菌中的激活条件德尔布鲁氏乳杆菌Rh2将其应用于黄芩苷的生物转化过程[16].由于模具具有丰富的酶,因此被广泛应用于生物转化过程中,但利用模具将黄芩苷生物转化为黄芩素的文献较少。
由于模具含有丰富的酶,因此常用于生物转化过程。米曲霉是一株含有蛋白酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、纤维素酶、植酸酶等多种酶的菌种,已安全应用于食品、饲料、曲酸生产、酿酒等工业领域发酵1000多年了。β葡糖苷酶也是一种重要的酶吗米曲霉并在黄芩苷的微生物生物转化中发挥了主要作用。Wu等人研究了发酵的条件米曲霉产β-葡萄糖醛酸酶,获得产率较好的培养基[17].本研究探讨了生物转化培养基中不同碳源和黑素源对黄芩苷生物转化的影响米曲霉优化碳源和氮源,提高其生物转化效率。
材料与方法
微生物和化学品
米曲霉经分离鉴定,保存于本实验室;黄芩基数,的根黄芩,是在中国湛江的一家药店购买的;黄芩苷和黄芩素标准品(纯度>98%,HPLC级)均购自中国国家工程研究中心医学中国南昌固体制剂;氨基酸如亮氨酸、半胱氨酸、组氨酸、氨基琥珀酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、胱氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸、谷氨酸和尿素均购自中国上海生工公司;甲醇,H3.阿宝4, KH2阿宝4, CaCl2, MgSO4尿素等试剂均为分析纯;玉米芯和豆粉是从中国湛江的一个市场购买的。
微生物媒介
采用三种培养基进行活化,中间培养米曲霉黄芩苷的生物转化。根据我们之前的研究[18)、集成土豆倾斜培养基和液体一体化土豆分别配制培养基进行活化和中间培养。生物转化介质参考Wu等报道的介质[17].
黄芩苷的提取、纯化及鉴定
从中提取黄芩苷黄芩基数,然后净化。然后采用薄层色谱法(TLC, thin layer chromatography)对黄芩苷进行鉴别,这在我们之前的研究中已经报道过[18].
培养基中黄芩苷含量的测定
黄芩素的测定采用高效液相色谱法,如我们之前的研究所述[18].首先制备100 μg/mL的balcalin / methonal溶液股票解决方案。然后股票分别稀释至10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL和50 μg/mL。用高效液相色谱法测定每种balcalin稀释溶液(20 μL)。根据各浓度balcalin的峰面积及其对应浓度,绘制标准曲线,得到回归方程。
激活米曲霉黄芩苷的生物转化
米曲霉在整合中被激活土豆然后将培养基斜转到液体中综合培养土豆培养基用于中间培养。之后,加入1ml液体土豆含培养培养基米曲霉加入250 mL生物转化培养基中。然后将0.2 g balcalin加入生物转化介质中,在摇床中摇3天。生物转化培养基(5 mL)用乙醚(2 mL × 4)提取,有机层组合。溶液蒸发至干燥,形成黄色固体。固体溶解在甲醇(10 mL)中,并与黄芩素标准对照,用高效液相色谱法测定。
balcalin转化率计算公式如下:
黄芩苷生物转化培养基中碳氮源的优化
以0.4% KH为基本培养基,对生物转化培养基中的碳源和氮源进行了优化2阿宝4, 0.04%氯化钙20.04% MgSO4.
采用0.1%蛋白胨作为生物转化介质的氮源,优化碳源。以玉米芯、麸皮、葡萄糖、可溶性淀粉为生物转化介质碳源。不仅通过改变玉米芯浓度来考察碳源的影响,还通过改变碳的含量来考察碳源的影响物种如2%麸皮,1%麸皮加1%玉米芯,2%葡萄糖,2%可溶性淀粉,甚至不含碳源。
采用生物转化效率最高的碳源对生物转化介质进行氮优化。首先,氮源的影响(蛋白胨,酵母提取物,豆粉,尿素,nhh4没有3.(NH4)2所以4固定0.1%和不含氮源进行评价。通过对最佳氮源的筛选,确定了最佳氮源浓度。其次,探讨0.01%浓度下单氨基酸(亮氨酸、组氨酸、甘氨酸、酪氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸等)的影响。第三,确定了不同浓度氨基酸与上述氨基酸组合以及氨基酸混合物与不同浓度尿素组合对黄芩苷生物转化的影响。
结果与讨论
黄芩素的测定
采用高效液相色谱法测定黄芩苷含量。结果表明,在10 μg/mL ~ 50 μg/mL范围内,黄芩苷的峰面积与浓度呈良好的线性关系。回归方程为y=58.68 × -23.772是0.99977。
生物转化介质中碳源的优化
玉米芯的作用:玉米芯被认为是大豆异黄酮生物转化的最佳碳源米曲霉[17].在此基础上,研究了不同浓度(分别为0% ~ 10%,w: v)玉米芯对balcalin生物转化的影响。结果表明,玉米芯不是黄芩苷生物转化的良好碳源米曲霉这与一般异黄酮的生物转化过程不同。当生物转化介质中不含玉米芯时,生物转化效率最高,达到37.1% (图1).为了提高生物转化效率,对其他类型碳资源的应用如下。
碳源的影响:研究了2% (W:V)碳源包括麸皮、等量麸皮与玉米芯组合、葡萄糖、可溶性淀粉、甚至不含碳源对黄芩苷生物转化的影响米曲霉探讨了。黄芩苷的生物转化效率一般为0.4% ~ 37.1% (图2).如图所示图2无碳源时,生物转化效率也最高。结果表明,黄芩苷的最佳碳源为黄芩苷本身,而非外界碳源。介质无碳源,用于后续的优化过程。
生物转化介质中氮源的优化
在此基础上优选氮源生物转化培养基,KH为0.4%2阿宝4, 0.04%氯化钙2, 0.04% MgSO4,无外部碳源,氮源0.1%。
无机氮源的影响:研究了0.1%蛋白胨、酵母浸膏、大豆粉、尿素、NH4没有3.(NH4)2所以4,即使没有氮对黄芩苷的生物转化也有影响米曲霉进行了评估。如图3,黄芩苷的生物转化效率为3.71% ~ 45.49%。蛋白胨、酵母浸膏、尿素和豆粉是黄芩苷生物转化的良好氮源米曲霉,生物转化效率为31.87% ~ 45.49%,以尿素最好。
不同尿素水平的影响:在上述氮源中,尿素是黄芩苷生物转化的最佳氮源。据此,测定0.01%、0.1%、0.5%和1%尿素对balcalin生物转化的影响(图4).随着尿素浓度的增加,生物转化效率先升高后降低。HPLC测定,当尿素浓度大于0.5%时,balcalin几乎完全生物转化,但随着尿素浓度的增加,balcalin含量减少。从文献来看,balcalin易于分解和氧化。结果表明,高浓度尿素加速了balbalin的分解和氧化。在生物转化过程中,为了提高balcalin的产量,同时考虑了balcalin的转化效率和balcalin的保护。因此,选择浓度为0.1%和0.01%的尿素作为氮资源,用于后续的优化工艺。
有机氮源-氨基酸的影响:14的影响物种研究了亮氨酸、半胱氨酸、组氨酸、氨基琥珀酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、胱氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸、谷氨酸等氨基酸对黄芩苷生物转化的影响(图5).以单个氨基酸为氮源时,balcalin的生物转化效率为9.43% ~ 27.43%,低于0.01%尿素的效果(为45.77%;图4).组氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酸在黄芩苷的生物转化中表现出较好的效果。并将这些氨基酸与尿素结合,以获得最佳的氮资源。
尿素与氨基酸不同组合的效果:本部分对黄芩苷生物转化的较好氮源进行了组合。保持氨基酸总浓度为0.01%、0.1%尿素、0.01%尿素,分别将6种优良氨基酸(组氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酸)进行组合,研究其对黄芩苷生物转化的影响。如图6其中,0.0017%精氨酸、0.0017%缬氨酸、0.0017%谷氨酸、0.0017%丙氨酸、0.0017%组氨酸、0.0017%酪氨酸和0.1%尿素为最佳氮源。
结论
β-葡萄糖苷酶也是一种重要的酶米曲霉并在黄芩苷的微生物生物转化中发挥了主要作用。优化生物转化介质中的碳源和氮源后,黄芩苷的生物转化效率提高到88.36%。最佳生物转化培养基优化为0.0017%精氨酸、0.0017%缬氨酸、0.0017%谷氨酸、0.0017%丙氨酸、0.0017%组氨酸、0.0017%酪氨酸、0.01%尿素、0.4% KH2阿宝4, 0.04%氯化钙20.04% MgSO4,无需外部碳源。
由此可见,无机氮与有机氮的结合有利于黄芩苷的生物转化,且无机氮在生物转化中的作用大于有机氨基酸。综合考虑生物转化效率和成本,0.1%尿素也是黄芩苷生物转化的良好氮源米曲霉因为氨基酸成本很高。
致谢
我们感谢匿名审稿人对这项工作的有益评论。本研究由中国石油创新基金(2015D-5006-0210)和国家自然科学基金(NO.)资助。41472124)。
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