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从孟加拉国不同石油污染地点分离的细菌种类的烃降解性评估

*通信:

Islam Sajib MS，系微生物学斯坦福德大学邮编:孟加拉国达卡1217 Siddeswari路51号电话:+ 8801679206611;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

石油产品的需求和使用日益增加，这反过来又增加了碳氢燃料在运输过程中意外泄漏、自然渗漏或由于基础设施的日常维护的可能性。由于清理溢油通常既困难又昂贵，因此迫切需要一种具有成本效益的技术来减少环境中过量的石油碳氢化合物。在这项研究中，能力微生物通过使用异质碳氢化合物燃料作为基质，对从孟加拉国不同石油污染地点分离出来的化合物进行了降解潜力的评估。采用布什内尔-哈斯琼脂(BHA)培养基分离和鉴定利用碳氢化合物的细菌。10种细菌物种在BHA上生长，以1%的石油碳氢化合物(汽油/辛烷值/柴油)液体形式作为唯一的碳源。分离物在37°C的轨道震动培养箱中孵育15天，以确定碳氢化合物的降解能力。石油降解量是通过重量分析确定的，重量分析是一种通过测量质量来确定化学物质含量的技术。汽油降解细菌以假单胞菌(Pseudomonas spp.， 58%)为主。在柴油和辛烷值降解的情况下，与其他菌株相比，Bacillus sp .被发现更有效，分别为79%和54%。

关键字

高压输电;电磁场;辐照;健康人体的;流行病学调查;大鼠;大脑;心脏和肌肉电信息;财产;变异

简介

碳氢化合物被认为是主要的来源能源遍及全世界。大量的燃料是必需的，特别是用于运输、工业生产和润滑。［1］．例如，它已通过水路运输到不同的地理位置，并广泛用于工业发展的目的[2］．然而，这些工业过程导致了石油泄漏的增加，几十年来，石油泄漏一直被视为一个主要的环境问题[3.，4，1］．石油污染如今已成为人们关注的主要问题，特别是对海洋生物而言，因为水体是石油泄漏的主要场所。1］．碳氢化合物污染物因其致癌和致突变的特性而对动植物生命构成危险[5，6，1，7］．

目前，科学家们正在寻找一些清洁技术，可以使我们摆脱这些长期的有害影响。1，8］．在各种清洁技术中，生物修复技术是最受欢迎的一种。与其他传统的清理系统相比，它是相对有效的，整个过程很简单[4，9-13］．到目前为止，五花八门微生物包括真菌、藻类和细菌，都能降解多环芳烃[14-17］．细菌在多环芳烃的完全矿化中起着重要作用。［18］．另一方面，真菌可以从生物学上将它们转化为无毒的代谢物，然后可以被其他生物作用[19］．

在这些生物降解细菌的重要特征中，添加细菌培养物以加快污染物降解速度和产生生物表面活性剂的生物增强作用是最重要的一种[20.-22］．生物表面活性剂作为乳化剂，改善碳氢化合物与细菌细胞的细胞接触，从而加强生物降解过程[LD乐动体育官网23，5，11］．然而，重金属等共同污染成分会通过造成额外的污染而干扰有机污染物的生物降解压力微生物种群[24］．因此，从石油污染地点分离烃类降解细菌在环境安全领域具有巨大的价值。据报道，已有几项研究从石油污染地区分离和鉴定细菌[25，26，13]，但到目前为止，缺乏关于孟加拉国的报道。9日，在孙德尔本斯的塞拉河发生了石油泄漏^th2014年12月，被联合国教科文组织列为世界遗产。一艘载有35万升石油的油轮(南方之星七号)燃料一艘货船与它意外相撞，突然沉入河中。泄漏的炉油蔓延超过140米²面积:17^th12月。在浮油蔓延到第二条河流和孙德尔本斯巨大的运河网络后，海岸线被染黑。由于这一可怕的事件，大量的树木、浮游生物、海豚和小鱼面临灭绝的威胁。考克斯巴扎尔、吉大港和勐拉、库尔纳等港口是我国石油泄漏的主要地点。此外，大量的燃料位于达卡市的一个泵可能是碳氢化合物降解细菌的来源。适当分离、鉴定和鉴定这些分离物可减少环境污染的威胁，因为它们的降解率更高，[8在石油污染的环境中，具有成本效益的程序和可用性。在这些方面，本研究试图分离和鉴定石油污染地区的细菌，并定量证明这些细菌的烃类降解能力，为将来在生物修复过程中进一步进行生物增强研究提供依据。

材料与方法

样品收集

在孟加拉国的三个漏油几率最高的地方采集了石油污染区域的样本。土壤样本取自Sirajganj Baghabari油库的一个石油污染地点。海水是从一个被船只污染的地方收集来的燃料(柴油)在考克斯巴扎尔。另一份海水样本采集自孙德尔本斯附近的巴施胡尔河。收集的样品转移到预先消毒、贴有标签的塑料袋/瓶中，小心运输到实验室，保持在4°C，直到进行微生物分析。

细菌总数的估计

采用平板技术对采集样品的细菌总数进行计数[27］．测量1 g土壤样品，无菌转入9 ml无菌生理盐水中。对从不同地点收集的1毫升水样进行相同的程序。然后他们被转移到一系列8倍稀释的生理盐水中。采用铺板法计数细菌总载量[27］．培养皿在37°C下孵育24小时。记录样品中存在的平均细菌数量。

烃降解菌群(HDB)

布什内尔-哈斯琼脂，每一窝蒸馏水含0.02 g MgSO₄.7H₂O, 0.02克氯化钙₂， 1g KH₂阿宝₄等于1g K₂HPO₄， 1g NH₄没有_3.， 2滴60% FeCl_3.用于组屋人口的培育。对于盐水样品，培养基中添加2% NaCl以支持海洋细菌的生长[21］．在无菌的布什内尔-哈斯琼脂(BHA)板中，使用无菌玻璃棒将0.1 ml无菌燃料(汽油/辛烷值/柴油)涂抹。采用0.22 μm膜过滤器对燃料进行杀菌。然后每个样品接种0.1 ml，铺于BHA [10］．培养皿在37°C孵育。只有石油降解细菌在平板上生长，因为这种介质中存在的碳源仅限于汽油/辛烷值/柴油，能够利用它们的生物只能在这种环境中生存。

石油(汽油/辛烷值/柴油)降解剂的鉴别:石油降解剂经若干常规显微和生化试验鉴定[28]根据柏吉的手册(表1)．观察和记录了细胞形态、菌落形态和结构外观等形态学特征。

表1:烃降解剂的生化鉴定。

石油(汽油/辛烷/柴油)降解试验:从BHA中分离出的培养物用作石油降解试验的接种剂。每个分离株取Erlenmeyer烧瓶(250 ml)，将100 ml Bushnell Haas肉汤培养基转移到每个烧瓶中并消毒[15］．使用1%的石油(汽油/辛烷值/柴油)作为唯一的碳源，在轨道激振器培养箱中，在37°C, 125 rpm下孵卵15天，进行筛选燃料降解率。每隔5天，用重量分析法估算石油的降解速率[15，10，29］．在所需的孵育期后，向每个烧瓶中加入1%的1n HCl以阻止细菌活性。为了提取燃料，将培养液倒入含有石油醚:丙酮(1:1)的分离漏斗中，并进行密集混合以得到单一乳化层。加入更多的丙酮来打破乳化，形成三个独立的层。两层底部被处理，因为只有顶层应该包含所需的石油与石油醚和丙酮混合。顶层收集在一个预先称重的烧杯中。将盛有丙酮和石油醚混合的油的烧杯置于水浴中，有机萃取剂在50℃蒸发。然后，烧杯冷却并再次称重。百分比燃料退化计算如下:

在那里,

剩余燃料重量=(燃料重量+烧杯重量)-烧杯原重量。

所有筛选实验都进行了5次，并将平均值绘制成图，以评估碳氢化合物的降解速率。

结果

目前的研究努力分离和识别微生物生活在石油污染地区，它们不仅能生存下来，而且还能通过利用石油碳氢化合物作为主要能源之一而茁壮成长。本研究还评估了这些细菌分离物对各种碳氢化合物的定量降解性，这些降解性可用于不久将来的任何生物修复研究(图。1)．

根据目前的研究，被测样品的异养细菌总数显示了显著的异养生物的存在。土壤样品的含量最高(2.1 × 10)⁶Cfu /g)，这是非常值得期待的，因为土壤被认为是微生物的主要库之一。其中一个样品的细菌数量较少。

烃降解菌群的鉴定

在任何污染环境中，微生物都是主要的烃类降解物生态系统［30.，20.］．在本研究中，样品在含石油烃的培养基中接种和孵育后，共观察到10株菌株在板上生长(表2)．在分离的细菌类型中，主要菌株被鉴定为假单胞菌spp．而且葡萄球菌spp.，其他属，如芽孢杆菌属，微球菌属．而且链球菌spp．并根据其显微和生化特征进行了鉴定。

表2:不同石油污染地区的石油降解细菌及其碳源不同。

根据Varghese [7]， Jyothi等人[10和象头神等人。[5柴油的降解主要由革兰氏阳性细菌完成。在这项研究中，我们发现70%的烃降解物是革兰氏阳性的，只有30%由革兰氏阴性生物组成(图。2)．其他研究也支持了这一数据，证明了革兰氏阳性细菌在石油降解中的高效[31-33］．然而，Subathra等人。17]显示革兰氏阴性菌在总烃降解物中占优势(62.34%)。我们的研究还表明，革兰氏阴性假单胞菌对汽油的降解效果显著(58%)。

石油(汽油/辛烷值/柴油)降解试验

烃降解实验显示不同的分离物有不同的结果。当分离物受到汽油降解时，发现降解最高的是假单胞菌spp．（图。3)．另一方面，葡萄球菌spp．给出了最低的汽油降解率。Nikhil等人[1]报道了假单胞菌对石油降解的效率高于微球菌。其他几项研究报告了石油降解的影响假单胞菌spp．在很长一段时间内[34，35，21］．

在柴油退化情况下，芽孢杆菌spp．柴油的降解率(79%)高于柴油微球菌spp．而且葡萄球菌spp．（图。4)．辛烷降解率最高和最低分别为54%和23%芽孢杆菌spp．而且葡萄球菌spp，分别(图。5)．Ghazali等人[36的有效行动的明确证据芽孢杆菌spp．清除溢油。革兰氏阳性菌的适应性增强芽孢杆菌spp．可使有机污染物以较快速度分解[37］．

讨论

采用经济、环保的净化方法对石油污染场地进行净化已迫在眉睫。“生物降解”是减少可生物降解污染物的最有效方法之一。与其他常规方法相比，该技术对污染场地的威胁较小，成本也较低[8］．

微生物种类繁多，其中许多有能力分解和利用复杂的有机污染物，如石油碳氢化合物[37，34，35，21，8]通过使用各种降解酶。不仅是细菌，蓝藻、绿藻和真菌也可以在不同的环境条件下通过碳氢化合物的时间代谢来降解石油[8］．

一些早期的研究揭示了一些细菌分离物的碳氢化合物降解性，如芽孢杆菌spp．而且假单胞菌spp．在那里，它们被证明是碳氢化合物最显著的降解物[34，35，21］．目前的研究也证明了这些微生物的有效降解能力。生物修复是一种具有成本效益的净化方式，由于其灵活性、可重复性、可获得性和生态友好性，未来可用于欠发达国家或发展中国家的此类场景。

结论

进行这项研究是为了分离和识别这些疾病微生物天然存在于石油污染地区，具有分解石油碳氢化合物的能力。我们知道，在所有的微生物中，假单胞菌spp．由于其酶活性和适应任何条件的能力，是最有效的石油碳氢化合物降解剂之一。在这项研究中芽孢杆菌spp．而且假单胞菌spp．被认为是最有效的石油碳氢化合物降解剂物种的微生物在孟加拉国周围的石油污染地区自然发现的。在未来，这些生物可以用于修复石油污染场地，因为与其他工艺相比，这种工艺成本更低，生态友好，并且具有更高的公众接受度。这项研究还可以集中于进一步经济的工业生产，用于汽油、柴油和辛烷值的降解。然而，由于这是一种自然的去污过程，有时需要大量的时间，但有这个缺点，生物修复比目前可用的任何其他治疗手段都更安全。

确认

我们感谢微生物学孟加拉斯坦福德大学实验室提供实验室设施、技术援助和财政援助。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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