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，卷:4(1)DOI: 10.37532/2454-9304.2021.4(1).141

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Western Blotting的应用与程序展望

*通信:

Pooja Aggarwal，印度泰伦加纳邦奥斯马尼亚大学微生物学系;电子邮件: (电子邮件保护)

简介

western blotting(有时称为蛋白质免疫印迹)或western smudging，是亚原子科学和免疫遗传学中广泛应用的一种有洞察力的方法，用于区分组织匀浆或提取物中的显式蛋白质。Western blotting策略利用三个组成部分来完成从不可预测的蛋白质中分离特定蛋白质的任务:按大小分割，将蛋白质移动到强大的帮助下，以及利用必要的辅助对抗剂来标记目标蛋白质以可视化[1]。推论出的工程或生物免疫反应(被称为必需免疫剂)是一种能够感知并与特定目标蛋白结合的蛋白质。的电泳在洗掉大量的免疫剂之前，胶片在含有必需的对抗剂的溶液中洗涤。添加一种辅助对抗剂，它能感知并与基本的免疫反应联系在一起。可选的对抗剂是通过不同的技术，如染色，免疫荧光和放射性，允许特定目标蛋白的异常鉴定。

其他相关方法包括斑点印迹检查，定量斑点涂抹，免疫组织化学免疫细胞化学，利用抗体来识别组织中的蛋白质细胞免疫染色、化学连接免疫吸附试验(ELISA)[1]。western blotting这个名字来源于Southern smudge，这是一种DNA识别方法，以其发明者、英国科学家埃德温·Southern的名字命名。同样，RNA的识别被称为northern blot。“西方印迹法”一词是由尼尔·伯内特(W. Neal Burnette)在1981年提出的，尽管实际的策略始于1979年瑞士巴塞尔弗里德里希·米歇尔研究所哈里·托宾(Harry Towbin)的研究机构。在1979年至2019年期间，“它已被引用在pubmed记录的超过40万份分布的标题、修改作品和口号中”，无论如何都可能是使用最多的蛋白质逻辑技术。

许多重要的蛋白原性和非蛋白原性氨基酸具有有机能力。例如，在人类大脑中，谷氨酸(标准的谷氨酸腐蚀性物质)和γ -氨基丁酸腐蚀性物质(“GABA”，非标准的γ -氨基腐蚀性物质)分别是主要的兴奋性和抑制性神经递质。羟脯氨酸是结缔组织胶原蛋白的重要组成部分，由脯氨酸组成。甘氨酸是红血小板中卟啉的生物合成前体。肉碱用于脂质运输。九种蛋白质原氨基酸被归类为人体的“基本”氨基酸，因为人体不能从不同的混合物中输送它们，因此应该作为食物摄入。其他的可能是限制特定年龄或疾病的基础。碱性氨基酸也可能发生变化物种物种。(b)由于氨基酸在有机中的重要性，氨基酸在营养方面具有重要意义，通常用于健康增强剂、肥料、饲料和食品创新。现代用途包括药物、生物可降解塑料和手性推动力的发明。

应用程序

western blot在自然化学中被广泛用于单个蛋白质的主观定位和蛋白质调整(如翻译后改变)。大约8-9%的蛋白质相关分布应用western blot进行评估。它被用作一种整体技术，在复杂的蛋白质组合中识别特定单一蛋白质的存在。蛋白质的半定量评估可以从大小和阴影的蛋白质带的印迹层。此外，应用已实现焦点的去污染蛋白的弱化系列可用于允许更精确的蛋白固定测量。western blotting通常用于克隆后蛋白质生成的确认。它还被用于临床诊断，例如，在艾滋病毒测试或疯牛病测试。的确定的艾滋病毒试验利用西方的污迹来识别敌我艾滋病毒人体血清试验中的反作用剂。来自已知hiv污染的蛋白质细胞被孤立和污迹在一个胶片上如上。然后，在此时，将待试血清应用于必需中和剂孵育过程中;免费的免疫反应被冲走，并添加了连接到催化剂信号的可选的人类反作用剂的敌人。然后染色组，在这一点上显示了患者血清中含有抗体的蛋白质。western blotting同样被用作变异克雅氏病的结论性测试，这是一种与使用带有牛海绵状的污染牛肉有关的朊病毒疾病脑病(BSE，通常被称为“疯狂的牛病”)[3]。

另一应用是兔热病的结论。对western blotting鉴别土拉氏杆菌抗体能力的评估发现，其亲和力几乎为100%，特异性为99.6%。几种类型的莱姆病检测利用了免疫印迹法。western blot也可作为确证性检测用于乙型肝炎疾病和HSV-2(2型疱疹)感染。在兽药中，western blotting有时用于确认猫的FIV+状态。

西方涂抹法的进一步应用包括世界反兴奋剂机构(WADA)的使用。血液兴奋剂是滥用特定的策略或潜在的物质来扩大一个人的红色血小板质量，使身体输送更多的氧气到肌肉，以这种方式增加耐力和执行力。有三种广为人知的用于血液兴奋剂的物质或技术，促红细胞生成素(EPO)，工程氧转运体和血液结合。根据世界反兴奋剂机构的禁用物质和方法清单，这两种物质都被排除在外。2014年国际足联世界杯期间，西方国家在反兴奋剂行动中使用了“抹黑”策略。Reichel等人在瑞士洛桑WADA授权实验室收集并分解了1000多个样本。正在进行的western blot检测显示，依赖于升级用于常规分析的原Velum SAR预制平板凝胶，进一步发展了对血液和尿液中EPO的识别。随着SAR- page与预制薄膜支撑的Velum SAR凝胶混合的接受，rEPO的小部分利用率的偏见限制得到了全面改善。

过程

西方的涂抹策略是用凝胶做的电泳通过三维结构分离局部蛋白质或通过多肽长度变性蛋白质，通过电泳交换到薄膜上(大部分为PVDF或硝化纤维)和免疫染色方法在印迹层上观察特定蛋白质。SDS-PAGE主要用于蛋白质的变性电泳划分。SDS在很大程度上被用作缓冲(就像在凝胶中一样)，使所有蛋白质都具有均匀的负电荷，因为蛋白质可以被着重地、相反地或公正地带电。这有点像电泳被称为SDS-PAGE (sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳)。在电泳之前，蛋白质测试定期起泡，以使存在的蛋白质变性。这保证了蛋白质的分离依赖于大小，并防止蛋白酶(分离蛋白质的化合物)破坏样本。电泳分离后，蛋白质被移到膜上(通常是硝化纤维或PVDF)。然后定期用Ponceau S对薄膜进行染色，以描绘斑点上的蛋白质，并确保发生合法的交换。接下来蛋白质被阻碍牛奶(或其他阻碍专家)来防止模糊的免疫限制，然后用对目标蛋白显式的抗体进行染色。最后，将用一种可选的对抗剂对该层进行染色，这种对抗剂可以感知主要的中和剂染色，然后可以通过各种策略进行定位。这种凝胶电泳Step is remember for western blotch检查以确定抗体[4]的交叉反应性问题。

参考文献

1. Polyansky A, Zagrovic B.磷酸化后表面疏水性变化水平的蛋白质静电特性。物理化学学报。2012;3:973-76
2. Quach NL，等。局部粘附激酶信号通路调节小穴蛋白3和β a1整合素的表达，这是正常成肌细胞融合所必需的基因。细胞的摩尔生物学。2009;20(14): 3422 - 35。
3. 在印迹程序中使用二抗来显示结合的一次试剂。电泳。1987;8(9): 398 - 402。
4. 拉斯穆森UF，拉斯穆森HN。人类股四头肌线粒体的功能特征。《鼹鼠与细胞生物化学》2000;208(1 - 2): 37-44。