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利用新型脂肪酶固定化功能化纳米生物催化剂从新分离的微藻种绿球藻中可持续生产生物柴油

*通信:

Ranjitha J、有限公司₂印度泰米尔纳德邦韦洛尔VIT大学研究与绿色技术中心电话:9952223180;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

本文的研究主要集中在可持续发展方面生物柴油利用新型脂肪酶固定化功能化纳米生物催化剂，从新分离的微藻菌株绿球藻生产。在该反应中，脂肪酶由黑曲霉(KP001169) a生成真菌从石油工业附近采集的石油污染土壤样品中分离出的菌株。以磁性纳米颗粒为载体，采用共沉淀法固定化脂肪酶，并将其作为纳米生物催化剂用于生产脂肪酶生物柴油生产。合成的纳米生物催化剂提高了生物柴油的收率。使用固定化脂肪酶磁性纳米颗粒作为生物催化剂，最高收率分别为88%。催化剂可重复使用5次以上生物柴油反应没有经过任何处理，活性发生变化，在第六次循环后合成的纳米生物催化剂活性下降。最后，采用GC-MS分析技术对脂肪酸甲酯(FAMEs)的组成进行了表征。

关键字

生物柴油;Chlorococcum sphacosum;脂肪酶固定化Fe3O4纳米颗粒;名声

简介

由于世界人口的迅速增加，需要化石燃料都将增加。由于它的几个缺点，生产的化石燃料是有限的。最近，研究人员和科学家开始更多地关注开发一种新的替代燃料来源。现在，人们已经对生物柴油生产采用不同的原料，如植物油、葵花籽油、棕榈油、菜籽油等浪费食用油等，[1-3.］．的成本生物柴油主要是根据原材料和其他工艺所涉及的生物燃料生产。目前生物燃料的成本是商用柴油的两倍，因为总金额的60%-70%用于购买原材料。因此，寻找石油的替代来源生物柴油合成是第三代原料，即产油微藻[4］．生物柴油与柴油相比有几个优点;具有运输方便、燃烧效率高、低硫和芳香族含量高，十六烷数高，可生物降解性好，温室气体排放少等生物柴油粘度高，粘度低能源含量高、云和倾点高、氮氧化物排放高、发动机转速和功率低、喷油器蒸煮、价格高、发动机腐蚀等，[5］．同时，影响酯交换过程的主要因素是醇的摩尔比、催化剂、温度、时间和搅拌速度等，目前生产生物柴油在腐蚀性化学催化剂(强酸或强碱)的存在下进行，导致产品收率降低[6］．近年来，固定化脂肪酶纳米颗粒在酯交换过程中发挥了重要作用。化学工艺的主要缺点是高能源输入,消除盐、难回收的甘油、皂的形成等，[7，8］．为了克服这些问题，酶酯交换被用作一种替代过程生物柴油生产。在此过程中，副产物甘油易于回收，避免了盐和催化剂的使用。与其他反应方法相比，酶促酯交换过程在温和的条件下产生高产量[9］．脂肪酶催化的酯交换反应分为两个步骤，其中包括酯键的水解和与第二底物的酯化。脂肪酶是一种替代催化剂生物柴油生产及环保[10-12］．固定化脂肪酶温度稳定，可作为可重复使用的催化剂。脂肪酶的可重复使用性解决了酶的高成本，使其成为一种合适的催化剂生物柴油工业规模生产。

材料与方法

化学物质

所有媒体组件都是从Hi-media购买的。化学试剂，包括橄榄使用的油，从Sigma-Aldrich(印度)购买，分析级，使用时没有进一步提纯。从石油污染土壤中分离得到黑曲霉(KP001169)，并用于进一步研究。

酶酯交换过程中不同甲醇配比的优化

酶酯交换反应在圆底瓶中进行，瓶中含有微藻油和300 mg脂肪酶固定化MNPs的反应混合物。将甲醇与海藻油的摩尔比优化为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6。将反应混合物置于磁性搅拌器中，分别保持45°C和400 rpm的温度约6小时生物柴油转换效率的计算和表示采用经验公式表示为;fame的重量除以含油量的重量。

酶酯交换过程不同温度的优化

为了优化反应温度，在油/甲醇的摩尔比为1:4的条件下，分别以400 rpm的速度改变反应温度，反应时间约6 h，并在15°C-55°C范围内研究了温度对反应的影响。对不同酶浓度的酶酯交换反应进行了优化。

通过添加不同浓度的脂肪酶固定化磁性纳米颗粒(100、200、300、400和500 mg)进行酶酯交换。反应在恒定的摩尔比1:4(油/甲醇)下进行，分别以400 rpm的速度改变纳米生物催化剂的浓度约6小时。

酶酯交换过程中不同摇速的优化

反应混合物由300 mg脂肪酶固定化磁性纳米颗粒组成，摩尔比为1:4(油/甲醇)，反应转速分别从100、200、300、400和500改变约6小时。

酶促酯交换过程中不同反应时间的优化

反应混合物由300 mg脂肪酶固定化磁性纳米颗粒组成，摩尔比为1:4(油/甲醇)，反应时间分别从2、4、6、8和10改变。

的生产生物柴油通过优化因素采用酯交换工艺

利用优化后的参数进行了酶促酯交换反应。反应混合物由原油与甲醇比例(1:4)组成，催化剂浓度为300mg脂肪酶固定化磁性纳米颗粒，与己烷100 mL混合制成反应混合物。将反应混合物置于磁性搅拌器中，分别保持45°C和400 rpm的温度约6小时生物柴油计算转化效率，用fame的重量除以含油量的重量表示。

固定化脂肪酶在酶酯交换过程中的重复利用

在相同的反应条件下，通过重复使用该催化剂进行酯交换反应来评估所制备的酶催化剂的可重复使用性，以估计其产率生物柴油在每个周期中。在每次酶酯交换过程后，用磁铁去除固定化的脂肪酶磁性纳米颗粒，并用己烷和超纯水洗涤两次以去除任何异物。

生物柴油的表征Chlorococcum sphacosum

脂肪酸甲酯的组成生物柴油产自Chlorococcum sphacosum采用GC-MS分析技术进行分析。类似地,燃料的属性生物柴油从Chlorococcum sphacosum使用标准的ASTM协议进行估计。对所制生物柴油的密度、粘度、比重、闪点、倒点、云点、酸值、碘值、皂化值、灰分、含水量等因素进行了分析，并与ASTM D0975、ASTM D6751和EN 14214进行了比较。

结果与讨论

甲醇:油比对酶酯交换反应的影响

甲醇:油比在生产中的作用生物柴油在酯交换反应条件下进行了优化;甲醇:微藻油(4:1)，300毫克脂肪酶固定化MNPs在温度45°C, 400 rpm分别约6小时生物柴油当摩尔比接近4:1时，收率为87.6%。但在摩尔比为5:1以上时，过量添加甲醇对产物的产率无显著影响生物柴油产量载于图1．El-Batal等人[13]报道了脂肪酶从黑曲霉用钡铁氧体磁性纳米颗粒包覆，当摩尔比为4:1时，产率最高可达90%。甲醇浓度的增加会影响FAME的转化。类似地，Jyothi ramalingam和Wang等人。[14]报道了高甲醇浓度抑制脂肪酶在FAME转化过程中的活性生物柴油生产。

温度对酶酯交换反应的影响

温度在酶作用中起着重要作用生物柴油的过程。研究温度对酶促FAME转化的影响生物柴油在此过程中，研究了该过程的温度范围在15°C-55°C之间，间隔5°C，分别在恒定转速为400 rpm下持续约6小时。在本研究中，FAME转化率增加到温度45°C并达到最大值生物柴油收率为88%。在提高反应温度后，FAME转化也没有显著增加，因为它通过变性蛋白质影响酶的活性，由于较高的温度，如图所示图2．Tran等人[15]报道FAME转换生产生物柴油C. vulgaris ESP-31通过酶促酯交换作用，当温度升高至50℃时，其活性降低。

不同催化剂浓度对酶酯交换反应的影响

研究了催化剂在45℃、400 rpm、恒温6 h条件下对酶酯交换反应的作用，发现300mg催化剂的催化效果最大生物柴油收率为87.6%。催化剂的用量在酶促酯交换反应中起着重要的作用，不同用量的催化剂范围为100 mg- 500 mg，如图所示图3．在低当酶浓度为100 mg时，酯交换过程不完全，导致a低生物柴油收率达到42%后，再增加催化剂的浓度对收率没有起到明显的提高作用。库马里等人。[16马塞拉等人。[17]和Jegannathan等人[18]报道，较高浓度的生物催化剂影响了底物的活性位点，因此酶的聚集将发生作为降低的结果生物柴油生产产量。过量的酶会降低脂肪酶的活性，降低脂肪酶的产率生物柴油生产(19］．

酶酯交换反应中反应时间的影响

通过改变反应时间，酶酯交换反应在恒定的温度、转速和催化剂浓度下发生。反应时间的影响生物柴油采用脂肪酶固定化生物催化剂将微藻油转化为FAME的最佳反应时间为6 h，收率最高可达88%图4．根据实验结果，如果通过增加反应时间来进行，则反应时间并没有显示出任何显著的增加生物柴油收益率(20.］．如果延长反应时间，经过一定时间后甲醇和甘油会抑制脂肪酶的活性[21］．

搅拌对酶酯交换反应的影响

在酶促酯交换反应中，搅拌是最重要的参数之一。库马里等人。[16]报道说固定只有适当地优化搅拌，反应才能正确地发生。反应物需要从散装液体扩散到颗粒的外表面，然后进入催化剂的内部孔隙。目的:研究激越对脑功能的影响生物柴油生产过程中，反应在100 RPM -500 RPM之间进行，间隔为100 RPM，如图所示图5．的最大百分比产量生物柴油在400 rpm时发现有87.6%。李与燕[19];Ognjanovic等人[22];Tran等人[15]报道，搅拌也提高了反应速率，它们在油与甲醇之间的传质阻力中起重要作用，进而在催化界面上固定化脂肪酶，最终提高反应速率。另一方面，当转速超过500转/分时，发动机的转速会降低生物柴油百分率也有所下降。这是由于固定化珠的损坏，导致机械搅拌过程中脂肪酶失活。

固定化酶催化剂在酯交换过程中的重复使用

脂肪酶固定化催化剂的主要优点是可重复使用。迦拉特和拉突[9]报道了催化剂的可重复使用性是决定工业规模酶的可能性的重要参数生物柴油生产。本研究主要基于固定化脂肪酶的稳定性和可重用性黑曲霉．即使在固定化酶催化剂使用五个循环后，脂肪酶活性也没有明显的损失，如图所示图6．之前的研究清楚地报道了固定化脂肪酶磁性纳米颗粒被使用约6个周期而没有任何损失生物柴油百分比收益率[15］．同样，Batal等人。[23]研究了固定化脂肪酶在磁性纳米颗粒上的活性，发现在第6个循环时没有任何负面影响生物柴油生产产量。只有在第7个循环时才观察到酶的逐渐损失，这是由于生物催化剂的洗涤导致脂肪酶从载体中泄漏。指出脂肪酶在甲醇分解反应中的构象变化和甲醇对脂肪酶的抑制作用可能是重复使用时酶活性下降的原因[24］．酶的可重复使用降低了甲酯的纯化成本和酶的成本[25］．

描述的生物柴油采用GC-MS谱分析

的生物柴油采用优化后的酶酯交换反应理化参数制备。利用气体对所得FAME进行了表征色谱法如图7而且表1。根据GC-MS结果，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸是必需的生物柴油被确定。

表1。绿球藻脂肪酸的GC-MS谱分析。

生物柴油的理化性质

结果表明，所制备的材料性能良好生物柴油与柴油标准进行了比较，如表2．基于这些结果低产品粘度生物柴油表明它可以直接用于现有的发动机，而且热值略低，因为所生产的生物柴油的含氧量百分比很高，这在传统柴油中是不存在的。产品中氧含量的存在生物柴油可能有助于达到完全燃烧。在生物柴油生产时，闪点更高，储存和运输更安全。十六烷数生物柴油被发现为57.6，这有助于良好的冷启动行为和平稳运行的发动机。如果燃料有低由于不完全燃烧，导致尾气排放量增加。十六烷数是衡量燃料从喷射到自燃之间延迟时间的相对指标[26］．在先前的报道中，认为粘度会影响雾化质量、液滴大小和渗透率。高粘度的问题燃料是燃烧不良，增加了废气和排放物。同时，也导致了大的形成燃料注射时滴，可能造成不良燃料喷雾过程中的雾化，增加了发动机的沉积物，需要更多能源泵出燃料，并磨损燃料泵元件和喷油器。密度影响空气-燃料比和燃油量生物柴油注入燃烧室。云点表示冷流特性生物柴油过高的不饱和度也会导致氧化问题，因此应加入稳定剂以延长其储存寿命生物柴油［27］．产品的闪点、倾点和云点生物柴油温度分别为155℃、-12℃和7℃。

表2。生物柴油的理化性质。

结论

目前的研究工作主要集中在低成本方面生物柴油从新分离的微藻生产物种从农用工业浪费水。分离出的藻类具有较高的脂质含量，然后通过物理和化学性质优化工艺参数以提高其脂质含量生物柴油生产产量。研究工作的主要优点是低成本、廉价的催化剂脂肪酶固定化磁性纳米颗粒。的催化剂固定解决了几个问题:重复和连续使用，相互作用的本地化，防止产品污染，减少出水问题和材料处理，以及有效控制反应参数。在本研究中，我们合成了一种新型催化剂用于生产生物柴油在FAME转化中取得了较高的转化率。另一方面，我们同样分析了产品的物理和化学性质生物柴油并与柴油ASTM和EN标准进行比较。在不久的将来，生产生物柴油可以作为绿色使用吗燃料在柴油机中。

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