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大肠杆菌检测使用甘氨酸涂层钴铁氧体纳米粒子

*通信:

Viswanathan K的兽医生物制品,转化研究平台、泰米尔纳德邦兽医和动物科学大学,Madhavaram牛奶殖民地,钦奈051年- 600年,印度泰米尔纳德邦,
电话:+ 0918754960627;电子邮件: (电子邮件保护)

文摘

在这个报告中,大肠杆菌检测方法是由使用甘氨酸涂层钴铁氧体纳米粒子(g / CoFe2O4)从饮用水收集调查样本。g / CoFe2O4纳米颗粒被用来捕获和分离的大肠杆菌的饮用水。检测是基于beta-glucuronidase酶存在于细菌溶菌产物。酶活性测定使用4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide水合物fluorogenic基质。大肠杆菌的校准曲线显示之间的线性范围是1×102 ~ 1×104 CFU /毫升(R2 = 0.9944)。最低检测浓度是1×102 CFU /毫升。开发新方法提供了最好的方法来确定大肠杆菌的水样总分析时间45分钟。

关键字

钴铁氧体纳米粒子;磁捕获;甘氨酸;细菌

介绍

水污染的主要问题是发展中国家,特别是细菌。三种不同的细菌经常监控等水体粪便细菌指标(FIB),大肠杆菌和enterococci1- - - - - -3]。的大肠杆菌目标生物的检测主要依靠种植需要相对较长的潜伏期(48小时),这带来了不便。以前聚合酶链反应放大为基础,基于核酸的检测,基于ELISA免疫测定和酶底物检测方法已经开发的人员。的聚合酶链反应和核酸检测还没有经常使用是因为他们不够敏感,设备是昂贵的,他们是特定于应变的,或者检测总而不是可行的细胞。此外,ELISA方法需要大量的样品制备步骤,还不适合现场快速监测(4- - - - - -6]。纳米技术与分析方法的结合有助于提高测定的灵敏度,降低运行成本和时间(7,8]。磁性纳米颗粒广泛应用于目标的特定的浓缩细胞从复杂的矩阵,由于他们强烈的外部磁场反应(9,10]。纳米粒子的表面改性使其效用和改变其内在特征。的程序集生物分子如抗体、酶和链霉亲和素纳米粒子表面的生物分析法(提供平台11- - - - - -14]。在水行业特定的酶生物标志物(β牛乳糖,β葡萄糖醛酸酶和β葡糖苷酶)基于细菌检测被广泛使用,细菌的浓度和恢复以前的样品他们使用注射器过滤器或其他铀浓缩技术。在这个工作我们开发了甘氨酸钴铁₂O₄纳米粒子作为浓缩纳米探针收集多达92%的大肠杆菌在20分钟。丰富的细菌细胞裂解和裂解缓冲β-glucuronidase浓度检测使用4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide水合物作为衬底。主要的优势,这种方法不需要任何复苏和前浓度步骤,分析在45分钟,非常适合现场监控。

材料和方法

甘氨酸涂层钴铁₂O₄纳米粒子

甘氨酸涂层钴铁₂O₄纳米粒子合成基于共同沉淀的方法。短暂,0.54 g一水合硝酸铁(ii), 0.234 g的硝酸钴(ii)六角水合物milli-Q-water溶解在20毫升,然后添加20毫升的氨气,样品在80°C加热和搅拌30分钟。最后25毫升的2.5 g的甘氨酸和加热的解决方案是添加了另一个90分钟终于收集粒子在8000转离心10分钟。合成甘氨酸涂层钴铁₂O₄粒子是由磁分离和收集反复清洗。修改的粒子的合成、添加氢氧化铵之后最终的解决方案是在80°C加热30分钟。合成粒子都是干在55°C和储存在室温下使用。量化的甘氨酸官能团在纳米颗粒表面是由茚三酮比色测定(15,16]。茚三酮试剂(500μL 0.2% w / v 0.1磷酸缓冲,pH值9)被添加到200μL纳米颗粒样品和混合在沸水浴中加热15分钟。样品冷却到室温和放置在一个磁分离器去除纳米粒子。上层清液的吸光度测量在570纳米微型板块和胺内容量化使用甘氨酸标准曲线。

磁组细菌

研究细菌的收集效率,5×10⁶CFU /毫升大肠杆菌拍摄和稀释平板计数(没有确认。殖民地×稀释系数)/接种量= CFU /毫升)和紫外吸收600海里。后的g涂层钴铁₂O₄纳米颗粒(上面的细菌分离物)样本孵化20分钟在37°C和绑定使用磁铁,以确定细菌被捕获效果基于板计数、光密度在600海里,也证实了使用TEM。

估计的俘获效率较低,大肠杆菌是连续稀释1×10¹CFU /毫升。上面的每个连续稀释25毫克/毫升的g涂层钴铁₂O₄纳米颗粒混合和孵化为20分钟37°C。一定数量的细菌(捕捉功效)决意镀上层清液的上层清液选择性琼脂和光学检测在600海里。

量化的细菌样本

如细菌检测涉及三个主要步骤:

1。甘氨酸涂层钴铁₂O₄纳米粒子的反应与细菌,磁分离和洗涤与PBS缓冲紧随其后。

2。除了与捕获的甘氨酸结合钴铁细菌裂解缓冲₂O₄粒子。

3所示。荧光测量。短暂,100年μl 25毫克/毫升的甘氨酸结合钴铁₂O₄粒子,100μl连续稀释细菌样本,和浓度从1×10¹~ 1×10⁶CFU /毫升加入1毫升eppendrof管。管是搅拌10分钟(手搅拌),并不断进行磁性分离器,游离细菌被移除和细菌绑定纳米颗粒与裂解细胞溶解试剂(2毫升)和积极混合5分钟和磁选紧随其后。分离溶菌产物是混合着50μl 4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide水合物在DMSO(100毫米)和荧光读取在445海里(激发波长365 nm)。

结果与讨论

纳米粒子合成基于有限降水过程使用一水合硝酸铁(ii)和六水合硝酸钴(ii)。硝酸铁(ii)之间的反应和硝酸钴(ii)离子催化用氢氧化铵。甘氨酸的表面修改,添加甘氨酸是在合成和北半球₂表面官能团。尺寸被确认通过SEM和它表明,大小约为10 nm to15 nm (图。1)。使用红外光谱证实了甘氨酸表面改性和所示的结果图1 b。。基于3394年的广泛的乐队¹和2916厘米¹确定与γ(哦),1383厘米¹(δCH₂首席运营官^{- - - - - -}甘氨酸与COO-group), 1105厘米¹和1031厘米¹属性NH^{3 +}像以前的publications16也记录相似。的vFe-O最高记录为587厘米¹和甘氨酸峰值被记录在1616厘米¹。比较我们还扫描钴铁₃O₄粒子和它显示广泛的乐队的3394厘米¹和2343厘米¹相关的γ(哦),1300厘米¹(首席运营官^{- - - - - -}组),596厘米¹归因于vFe-O, 1629厘米¹表示NH一半的存在。纳米粒子的x射线衍射(XRD)模式与标准JCPDS相比索引模式和参考卡号是:22 - 1086基于峰值对应的飞机(3 1 1),(4 4 0)和(2 2 0)证实了纯钴铁的形成阶段₂O₄定义良好的尖晶石结构。甘氨酸修改钴铁₂O₄像钴铁纳米粒子表现出特征的飞机一样₂O₄这表明,甘氨酸表面改性不影响粒子的晶体结构(图。2)。元素组成的纳米颗粒被估计使用EDX探测器和所示的结果图2 b。。英国国教会₂O₄纳米颗粒显示78.93 wt %的铁,11.88 wt %的股份有限公司,7.96 wt %的O和1.23 wt %的氮。g /钴铁₂O₄纳米粒子含有58.15 wt %的铁,19.21 wt %的股份有限公司,20.93 wt %的O和1.70 wt %的氮。氮的增加重量百分比表示,甘氨酸钴铁上的成功结合₂O₄纳米粒子。纳米粒子的磁敏感性测定使用特点和结果所示图2 c。。从饱和磁化曲线(Ms)钴铁的价值₂O₄纳米粒子被发现emu / g和50.232 g /钴铁₂O₄纳米颗粒显示磁化的值是49.24 emu / g。

甘氨酸组估计15.5 nmol甘氨酸/毫克的纳米颗粒。在我们的研究中,纳米颗粒表面上的胺密度估计0.437μmol / mg纳米颗粒。此胺内容对应15.6 nmol甘氨酸/毫克的纳米颗粒。研究细菌收集效率,细菌分离连续稀释到5×10⁶CFU /毫升,用钴铁孵化₂O₄和g /钴铁₂O₄纳米粒子。的结果,我们发现g /钴铁₂O₄纳米粒子表现出最大92%±1大肠杆菌。英国国教会₂O₄纳米粒子表现出25±3.01%大肠杆菌和他们绑定被证实与TEM和镀方法(图。3)。甘氨酸分子在纳米粒子表面为非特异性细菌绑定提供了氨基酸。水样本的收集的流感细菌细胞溶解裂解缓冲和具体大肠杆菌表面标记被允许与特定的底物反应如4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide水合物和化学反应所示图。3。最初实验参数如底物浓度、培养时间进行了优化。确定β-gal释放细胞溶解细菌细胞的浓度,不同浓度的细菌(0毫升⁻¹,10⁵毫升⁻¹,10⁶毫升⁻¹和10⁷CFU毫升⁻¹)被eppendroff管和混合2毫升的裂解缓冲和大力混合5分钟。之后,溶解产物是混合着50μl 4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide水合物(100毫米)和吸光度测量在不同的时间间隔0分钟,10分钟、20分钟,30分钟和60分钟。同样的实验也表现使用纳米颗粒,测定酶活性在不同的时间间隔。我们发现20分钟后的强度是相同的样本。所以我们分析固定20分钟就够了。

我们也优化底物浓度在这项研究中我们使用浓度增加大肠杆菌(10⁷CFU /毫升⁻¹)。这是孵化与纳米粒子10分钟,其次是裂解和磁分离。溶菌产物是孵化与不同浓度的4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide水合物(25毫米至150毫米在DMSO)。底物的吸光度随着浓度的增加而增加,倾向于平整后的浓度为100毫米。因此,一个4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide水合物100毫米被选中作进一步的酶浓度实验。在最优条件下,检测不同浓度的甘氨酸介绍了涂布纳米颗粒大肠杆菌。甘氨酸钴铁结合₂O₄纳米粒子暴露在不同的细菌浓度介于1×10¹~ 5×10⁶CFU /毫升。捕获细菌与PBS缓冲洗和紧随其后的是裂解和裂解缓冲10分钟和溶菌产物收集使用磁铁和还混合着4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide水合物和红色产品转移到一个96孔板得到荧光读数(激发波长365 nm和发射波长445 nm)。酶产品提高单体的荧光强度增加细菌浓度和所示的结果图。4。根据吸光度,我们可以反复检测细菌浓度在1×10²CFU·毫升⁻¹(p < 0.05)。线性是获得从1×10²~ 1×10⁴CFU /毫升(R²= 0.9944)。最低检测浓度是1×10²CFU /毫升和inter-intra-assay累积值(CV)获得5.03%,6.23%,6.50%,5.34%,5.11%,7.21%为1×10之间的范围¹CFU /毫升~ 1×10⁶CFU /毫升。这些结果表明,CV值小于10%,因此该方法是高度可再生的。的特异性试验是评估使用常见的病原菌菌株作为竞争对手,包括沙门氏菌血清(美国血清),金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)。每个菌株在不同的细菌浓度(10⁶CFU /毫升)或混合大肠杆菌解决方案和结果表明,特定的颜色变化,观察吸光度的存在大肠杆菌细胞它证明了这种方法具有良好的特异性的方向大肠杆菌。发达的纳米颗粒分析当时申请在水中细菌的检测样本。水样本飙升了5×10²5×10³1×10⁴1×10⁵和5×10⁵CFU /毫升的细菌。分析显示的平均荧光强度值(a.u)没有水的细菌如0.082±0.02,0.79±0.04,1.521±0.06,2.66±0.51,4.350±0.50。细菌水样品显示的值分别为0.080±0.03、0.80±0.02、1.454±0.07、2.60±0.9、4.35±0.5。根据结果我们发现分析非常适合在水中细菌检测样品。

结论

在结论中,甘氨酸钝化钴铁氧体纳米粒子被成功合成,用作诊断工具大肠杆菌检测。的大肠杆菌检测是基于酶释放细菌细胞表面标志。发达的方法是快速、敏感,避免了造粒和离心步骤并提供稳定的信号,灵活的平台和孵化时间短。

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