原文
，卷:12(2)

• 查看PDF
• 下载

硒对戊康唑致成年大鼠肝毒性的影响

*通信:

Ben Saad H突尼斯斯法克斯3029斯法克斯大学医学院药理学实验室
电话:+216 74 241 888;传真:+216 74 246 217;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

本文研究了戊康唑(TEB)对成年小鼠肝脏的毒性作用及对其矫正作用硒(Se)。雄性Wistar大鼠被分为三组，每组6只:I组为对照组;第二组给予巴别坦(TEB)单独腹腔注射(100 mg/Kg b.w)，第三组给予巴别坦和硒(0.5 mg/Kg日粮)，持续30天。结果表明，在teb处理组，抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)、脂质过氧化、高级氧化蛋白产物和蛋白质羰基水平显著升高，而谷胱甘肽过氧化物酶活性下降。通过大鼠饮食共同给予硒使这些参数恢复到接近正常值。TEB治疗引起肝脏的各种组织学改变，包括白细胞浸润和细胞质空泡化，而TEB和Se治疗导致肝脏组织学图像的改善。因此，我们的研究表明，硒可以有效地预防teb诱导的肝毒性。

关键字

Tebuconazole;硒;氧化应激;肝;抗氧化剂

缩写

AOPP:高级氧化蛋白产品;猫:过氧化氢酶;GPx:谷胱甘肽过氧化物酶;谷胱甘肽,谷胱甘肽;MDA:丙二醛;NBT:硝基蓝四氮唑;PCO:蛋白质羰基;ROS:活性氧;Se:硒;SOD:超氧化物歧化酶; TEB: Tebuconazole Species; SOD: Superoxide Dismutase; TBARS: Thiobarbituric Acid Reactive Substances; T-Ch: Total Cholesterol; TG: Triglycerides

简介

日益增长的农业和工业活动在很大程度上造成了环境污染，从而影响到作为污染终点的水系统[1］．在试验化学品中，可以提到具有保护、治疗和根除作用的唑族全身性杀菌剂戊康唑(TEB)。近年，巴巴在溪流水域的出现有所增加[2]，在地表水中检测到的浓度为175-200 g/L [3.］．巴布对大鼠后代具有抗雄激素和雌性化作用[4］．事实上，它已经被广泛使用，因为它对各种蘑菇、黑穗病和短打病有有效的作用。实际上，巴布是一种强有力的异种生物，接触它可导致各种生物的代谢改变和死亡。它已被美国环保署列为c类可能的人类致癌物[5］．对大鼠的研究表明，围产期暴露于TEB会产生免疫神经行为和神经病理缺陷。然而，关于其对肝组织的影响的信息仍然很少[4］．

鉴于杀菌剂暴露与氧化应激之间的关系，具有抗氧化性能的化合物已成为研究的重点。事实上,硒是一种在土壤和食物中少量存在的微量元素，在区域分布和生物利用度上有显著的变异性[6］．它是包括人类在内的哺乳动物的基本膳食成分。它也是几种酶的结构成分，包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和硫氧还醇，它们在细胞氧化防御中起关键作用，并已被证明是由氧化应激诱导的。硒被发现牵涉到一些健康问题。值得注意的是硒缺乏症也会在不同程度上影响所有的硒蛋白，这取决于它们在硒蛋白层次结构中的位置。

因此，本研究旨在阐明戊康唑对成年大鼠肝组织的影响以及硒的保护作用。

材料与方法

动物

从突尼斯中央药房购买的成年大鼠被安置在环境温度21±3°C的环境中，并自由给予商业饮食和自来水。有关在科学调查中使用及照乐动KENO快乐彩顾活体动物的一般指引，已被严格遵守[7］．

实验设计

选用Wistar品系雄性大鼠18只，随机分为3组，每组6只。第1组为对照组，以腹腔注射油玉米为载体;第二组以腹腔注射的方式给予TEB (100 mg/kg b.w)，第三组(TEB+Se)给予TEB (100 mg/kg b.w)，并在其饮食中添加0.5 mg/kg硒。TEB和Se的剂量和给药方式是根据现有文献资料选择的[8，9］．治疗30天。

蛋白定量

肝蛋白质含量是根据Lowry等人确定的。[10以牛血清白蛋白为标准。

丙二醛(MDA)测定

按Draper和Hadley方法测定肝脏MDA浓度[11］．将肝脏匀浆和三氯乙酸混合，以2500转/分的速度离心。将1 mL硫代巴比妥酸试剂(0.67%)加入500 μL上清液中，90°C加热15 min，冷却后在532 nm处分光光度法测定。MDA值以nmol /g肝脏表示。

高级氧化蛋白产品(AOPP)

AOPP水平参照Kayali等方法测定。[12］．取0.4 mL提取物，用0.8 mL磷酸盐缓冲液(0.1 M;pH值7.4)。两分钟后，向试管中加入0.1 mL 1.16 M的碘化钾，然后加入0.2 mL醋酸。在340nm处测定反应混合物的吸光度。AOPP浓度以μmol/mg蛋白表示。

蛋白质羰基(PCO)含量

采用Reznick和Packer方法测定肝脏PCO含量[13］．以DNPH摩尔消光系数(ε 2.2 × 104 cm-1 M)为计算依据^－1)，并以每毫克蛋白质的微摩尔表示。

肝脏谷胱甘肽(GSH)含量

肝脏中谷胱甘肽含量按照Ellman所述方法测定[14]并经Jollow等人修改。[15当DTNB(5,5-二硫代-2硝基苯甲酸)被添加到含有巯基的化合物中时，会产生黄色。简单地说，将3 mL磺基水杨酸加入500 μL的肝脏匀浆磷酸盐缓冲液中。2500 xg离心15分钟，上清500 μL加入Ellman试剂。在412 nm处测定吸光度。谷胱甘肽含量以mg/g肝脏表示。

抗氧化酶活性

在磷酸盐缓冲液中稀释的肝脏匀浆中测定酶活性。

总超氧化物歧化酶活性(SOD)

根据Beauchamp方法，在560 nm处用分光光度法测定SOD活性。16］．反应混合物包括50 mM肝脏匀浆磷酸钾缓冲液(pH 7.8)， 13 mM甲硫氨酸，0.1 mM EDTA, 2 mM核黄素和75 mM硝基蓝四唑(NBT)。在560nm处测量反应中产生的蓝色。SOD活性单位表示为抑制NBT还原50%所需的酶量，活性以每毫克蛋白质的单位表示。

采用Aebi法在240 nm处分光光度法测定CAT活性[17］．加入20 μl的均质组织和底物(H₂O₂)到0.5 M浓度的介质中含有100 mM磷酸盐缓冲液，pH为7.4。在240 nm处记录吸光度变化。CAT活性以μmol H表示₂O₂消费/分钟/毫克的蛋白质。

GPx活性的测定采用Flohe和Gunzler方法[18］．GPx催化还原性谷胱甘肽氧化氢过氧化物异丙烯。简单地说，将200 μl均质组织加入200 μl还原型谷胱甘肽还原酶(4 mM)和100 μl 100 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原形式(NADPH)的存在下，氧化还原性谷胱甘肽立即转化为还原性形式，同时伴有NADPH- NADP的氧化⁺．测定在340 nm处的吸光度下降，酶活性以氧化谷胱甘肽的nmol /min/mg蛋白表示。

组织病理学检查

肝脏标本置于10%缓冲福尔马林溶液中，石蜡包埋，5毫米厚切片，苏木精-伊红染色进行组织学研究。每个肝脏制备4片玻片。所有切片均评估肾小管和肾小球损伤程度。

统计分析

使用统计包程序Stat view 5 Software for Windows (SAS Institute, Berkley, CA)对数据进行分析。统计分析采用单向方式。方差分析(ANOVA)之后的Fisher 's Protected Least Significant Difference (PLSD)检验作为组间比较的事后检验。所有数值以均值±标准差表示，p<0.05为差异显著。

结果

脂质过氧化作用

我们的结果显示，在巴提巴处理的大鼠中，肝脏脂质过氧化水平显著增加，MDA水平升高就是明证。事实上，在teb处理的大鼠肝脏匀浆中，MDA水平显著增加(175.86 nmol/g组织)，是对照组(126.37 nmol/g组织)的两倍。饲粮中添加硒(TEB+Se)组肝脏中MDA含量(146.43 nmol/g)较TEB组(图。1)．

每组6只动物用均值±S.D表示。比较如下:

TEB和TEB+Se组与对照组比较:**p<0.01。

TEB+Se组与TEB组比较:+:p<0.05。

肝脏AOPP水平

图。2显示AOPP值，AOPP是对照组和治疗组大鼠肝脏组织中蛋白质氧化损伤的标记物。teb处理大鼠肝脏匀浆中AOPP含量(1.07 μmol/mg蛋白)显著高于对照组(0.71 μmol/mg蛋白)。饲粮中添加硒可使teb处理大鼠肝脏AOPP (0.94 μmol/mg蛋白)水平较teb处理大鼠降低。

每组6只动物用均值±S.D表示。

比较如下:

TEB组和TEB+Se组与对照组比较:* p<0.05;* * p < 0.01。

肝脏PCO水平

与对照组(1.36 nmol/mg蛋白质)相比，经teb处理的大鼠肝组织中PCO水平增加(2.31 nmol/mg蛋白质)(图。2)．与teb处理的大鼠相比，在饮食中补充硒导致肝脏PCO水平(2.72 nmol/mg蛋白质)降低(图。3)．

比较如下:

TEB组和TEB+Se组与对照组:***p<0.001。

TEB+Se组与TEB组比较:+:p<0.05。

抗氧化酶活性肝脏谷胱甘肽水平

暴露于TEB的大鼠肝脏谷胱甘肽水平明显增加(+50%)(表1)．与TEB组相比，TEB+Se组GSH水平降低。

表1。酶促抗氧化活性(谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶)和成年大鼠心脏中的谷胱甘肽水平在30天内与TEB或TEB+Se进行对照。

肝脏中的酶抗氧化状态

对照组和处理组的CAT、SOD和GPx抗氧化酶活性为表1．TEB处理使TEB组CAT活性较对照组显著提高47%，GPx和SOD活性较对照组显著降低(分别为-73%和-63%)。

肝脏组织病理学

光镜检查显示对照组肝脏结构正常(图。4)．暴露于TEB会导致器官发生退行性变化。事实上，TEB引起炎症性白细胞的浸润细胞和肝细胞空泡化(图4 b。而且4摄氏度)．严重肝损害明显减轻硒与仅给予巴巴治疗的大鼠相比，在巴巴治疗的大鼠的饮食中添加了图4 c。)．

光学显微镜:苏木精-伊红，X 400。

箭头表示:白细胞炎性细胞;充血的中央静脉;肝细胞液泡化。

讨论

目前的研究旨在探讨维生素d的保护作用硒抗巴铁造成的大鼠肝损伤。丙二醛是组织中氧自由基诱导脂质氧化反应产生的脂质过氧化物的代谢产物之一。我们的研究显示，巴巴治疗组肝脏中MDA含量增加。此外，自由基生成的增加可能导致蛋白质的修饰，导致侧链中羰基的形成和/或敏感氨基酸中巯基的减少[19］．

研究还发现，可能由TEB处理产生的ROS诱导了蛋白质氧化损伤的标志物PCO和AOPP水平的升高。我们的研究结果表明，硒治疗可以防止大鼠的脂质过氧化和蛋白质氧化，从而减轻teb引起的肝损伤。抗脂质过氧化可能源于硒清除活性氧的能力。

此外，可能是由于抗氧化酶活性降低导致了TEB处理后脂质过氧化水平升高。

谷胱甘肽是一种重要的细胞功能调节化合物。与对照组相比，经teb处理的大鼠观察到谷胱甘肽水平升高，表明谷胱甘肽耗竭导致脂质过氧化增强[20.］．与对照组相比，硒组GSH抗氧化酶活性显著降低。谷胱甘肽活性的降低可能是由于其底物的可用性降低和谷胱甘肽的减少[20.］．

GPx是一种依赖于gsh的抗氧化酶[20.］．含硒GPx的生化功能是将脂类过氧化氢还原为相应的醇，并将游离过氧化氢还原为水[21］．SOD催化超氧阴离子变性生成过氧化氢，过氧化氢再被过氧化氢酶解毒生成过氧化氢。过氧化氢酶是一种常见的酶，几乎存在于所有生物体中，其作用包括催化过氧化氢分解成氧和水[22］．TEB单独处理使GPx、CAT和SOD活性发生显著变化，Se处理则显著提高了这些参数。

肝功能障碍的调查与肝脏组织学研究相关。事实上，TEB治疗导致肝脏炎症性白细胞浸润、空泡化和坏死。这些改变可能是由于ROS的产生与生物靶分子相互作用，从而引起肝损伤和teb诱导的膜分布。补充硒促进肝脏结构再生。

事实上，在teb处理的大鼠饮食中共同给予Se后，肝脏细胞结构显示正常。结果表明，硒可减轻teb所致的肝损伤。确实，正如之前的研究报道的那样，硒作为一种抗氧化剂，抑制细胞膜中脂质和载脂蛋白的氧化过程[23，24］．

结论

综上所述，目前的研究表明，TEB增强了成年小鼠的脂质过氧化和蛋白质氧化，与GSH水平的升高和抗氧化酶活性(GPx, SOD和CAT)的改变有关，并引起了肝脏组织学方面的损伤。我们的结果还表明，teb诱导肝毒性由于ROS的产生而导致肝脏损伤。补充硒可以改善氧化应激。因此，应该确认补充天然抗氧化剂可以作为防止农药毒性的保护剂。

参考文献

1. 付杰，麦波，盛刚，等。珠江三角洲环境中持久性有机污染物研究综述。乐动体育在线臭氧层。2003;52:1411-22。
2. 王晓明，王志强，王志强，等。周边生物作为评估土地利用对河流影响的多计量生物指标:ArdiSres-Morcille实验流域概述。乐动体育在线Hydrobiologia。2010;657:123-41。
3. 埃尔萨瑟D，舒尔茨R.在植被农业地表水杀菌剂污染的缓解:GIS建模和现场监测。见:SETAC欧洲第18届年会会议记录。SETAC，华沙，2008;406 - 7。
4. 张志刚，张志刚，张志刚，等。内分泌失调的活动在活的有机体内杀菌剂戊康唑和环氧康唑。化学通报，2007;21(3):464-73。
5. 环境保护署。被评估为潜在致癌物的化学品。农药项目办公室，美国环境保护署，华盛顿特区。2006.
6. Montgomery R.糖原测定。生物化学，1957;67:378-81。
7. 欧洲共同体理事会关于保护用于科学调查的活体动物的理事会指令。欧洲共同体官方公报(jo86 /609/CEE)。1986; 358:1-18。
8. 王晓燕，王晓燕，王晓燕，等。围产期戊康唑暴露对成年大鼠神经、免疫和生殖功能的影响。科学通报2001;62:339-52。
9. 马科维奇，马科维奇，马科维奇，等。慢性镉暴露对大鼠部分组织抗氧化防御系统的影响:硒的保护作用。物理学决议2008;57:403-11。
10. 罗瑞华，罗森伯勒，法尔。用福林酚试剂测定蛋白质。生物化学学报。1951;193:265-75。
11. Draper HH, Hadley H.丙二醛测定作为脂质过氧化指标。方法生物化学学报。1990;86:421-31。
12. Kayali H, Young VE, Barkey K.《帝国到国家:现代世界形成的历史视角》。编辑:罗曼和利特尔菲尔德出版社系列:世界社会变化，2006。
13. 蛋白质的氧化损伤:羰基法分光光度法。Enzymol。1994;233:357 - 63。
14. 组织巯基。生物化学，1959;82:70-77。
15. 乔洛DJ，米切尔JR, Zampaglione N.溴苯致肝坏死。谷胱甘肽的保护作用和3,4 -溴苯氧化物作为肝毒性代谢物的证据。药理学。1974;11:151 - 169。
16. 超氧化物歧化酶:改进的测定方法和适用于丙烯酰胺凝胶的测定方法。《肛门生物化学》，1971;44:276-87。
17. 过氧化氢酶在体外方法。Enzymol。1984;105:121-26。
18. Flohe L, Gunzler WA。谷胱甘肽过氧化物酶测定法。Enzymol。1984;105:114-21。
19. 哈利维尔B, Gutteridge JMC。自由基研究综述述评生物学收录:巴里·哈利维尔和约翰·MC·古特里奇，编辑。自由基生物学杂志1992;12:93-95。
20. Karthikeyan K, Sarala-Bai BR, Niranjali DS。葡萄籽原花青素对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤的保护作用。国际心脏病杂志2007;15:326-33。
21. 冉Q，梁红，伊基野Y，等。谷胱甘肽过氧化物酶的降低通过增加对细胞凋亡的敏感性来增加寿命。老年医学杂志，2007;62:932-42。
22. 郭志强，张志强，等。过氧化氢酶在人红细胞内过氧化氢处理中的主要作用。血。1996;87:1595 - 99。
23. 麦克弗森。硒维生素E和生物氧化进:Cole DJ, Garnsworthy PJ，编辑。动物营养学的最新进展。牛津:Butterworth and Heinemann, 1994;3-30。
24. Murray RK, Granner DK, Mayes PA，等。哈珀生物化学(兰格医学书籍)。国际版。阿普尔顿和朗朗格医学出版社，奥尔巴尼，纽约，988;574-76。