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，卷:12(8)

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用臭臭草和印楝叶提取物对西瓜(采后)中病原真菌的生物处理

*通信:

Oladeji O拉达克阿金托拉理工大学纯化学与应用化学系硕士B 4000，尼日利亚Ogbomosho，
电话:+ 2348065950608;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

在一个饥饿的世界和不断增长的人口，努力减少作物损失由于病原体感染。近年来，合成杀菌剂的应用被证明能有效抑制植物病原真菌的生长，这大大增加了使用，从而造成了许多有害影响，如健康还有环境问题。为了解决这一问题，许多国家制定了使用杀菌剂的规章制度。在植物微生物的处理中使用植物化学物质已被发现是更好的选择。因此，有必要分离和鉴定与西瓜果实(采后)变质有关的致病真菌，采用不同植物叶片提取物对其进行处理是必然的。植物提取物的活性最高的部位是高浓度提取物;显示了浓度对易感生物的影响。因此，由于植物化学物质的存在，臭草和印度香可以作为天然的杀菌剂抑制植物病原真菌的生长。因此，可作为化学工业中生产杀菌剂的潜在原料。

关键字

农药;杀真菌剂;致病菌;植物病原;微生物

简介

植物具有合成芳香族次生代谢产物的能力，如酚类、酚酸、黄酮、黄酮、黄酮醇、单宁和香豆素[1］．具有酚类结构的成分，如香芹酚、丁香酚和百里香酚，对病原体有很高的活性。这些化合物具有抗菌作用，可作为植物对病原菌的防御机制微生物［2］．

Citrullus lanatus是一种豆科植物，原产于尼日利亚、加纳、印度和世界上许多地方，最近的研究发现，它含有高含水量，具有不同形状(大小)和外皮图案的迷人外观[3.］．水果的可食用部分(肉质部分)被认为是有营养和药用的;因此，这使得种子被视为废物。种子含有不同比例的植物化学物质，如碳水化合物、苯酚、类黄酮、蛋白质、纤维、磷和铁[4］．经近似分析发现，该种子含有脂肪(47.9%)、蛋白质(27.4%)和碳水化合物(9.9%)[5］．这些植物化学物质的存在有助于缓解炎症，并提高身体系统的消化能力。6］．

切片水的消耗量有了显著的增加瓜因为它们营养丰富，方便，容易获得，而且比整个水果便宜。西瓜通常产自尼日利亚北部各州以及非洲、亚洲和欧洲的部分地区。由于处理不当、气候、虫害等因素，水果受到病原体污染的情况日益严重。在许多不卫生的环境中，水果的卫生状况仍然很差或受到污染，因为细菌载量中等高[7］．

植物病原真菌一般由合成杀菌剂控制。由于杀菌剂对人类及其环境造成的问题，对它们的使用有严格的规定;尽管不断的使用，这些致病真菌在植物中已经产生了很强的抗性，因此，必须采取防治措施来克服这一问题。植物化学物质已引起微生物学家和植物科学家的关注，从植物材料中提取的抗微生物植物化学物质已被发现可降解且对人体安全健康［8］．因此，分离鉴定与西瓜果实采后变质有关的致病真菌，并采用不同植物叶片提取物对植物病原体进行处理是必然的。

材料与方法

样品收集

成熟的西瓜果实从尼日利亚奥约州Ogbomosho的Adenike地区购买和收集。水果用蒸馏水冲洗，并保存在一个干净的塑料袋中。叶子Chromolaena odorata而且Azadirachta indica采集自Ogbomosho劳泰克农业科学农场，并在尼日利亚Ogbomosho劳泰克纯粹与应用生物学系植物标本室进行鉴定和鉴定。

制备及提取c . odorata而且答:籼稻叶子

新鲜的c . odorata而且答:籼稻叶片清洗干净，在烤箱中15°C保存5天。将干燥的叶片粉碎，通过20毫米的筛网进行筛分。大约50克c . odorata采用Adelowo和Oladeji[9]方法对叶片进行精确称量和提取，并进行少量修改。用旋转蒸发器浓缩得到的提取物。浓缩提取物4℃保存于样品瓶中。该方法重复进行答:籼稻叶子。

清理

所用色谱柱为耐热玻璃，直径小，分离效果好，色谱带明显。清理方法参照Adelowo和Oladeji的方法[9］．

介质准备

大约39克土豆称取葡萄糖琼脂，溶于1000毫升蒸馏水中。在1000ml无菌培养基中加入约1ml的四环素，以无菌方式抑制细菌生长;然后将其倒入无菌培养皿中。采用高压灭菌器在121℃下灭菌15 min制备PDA介质。用70%乙醇和无菌蒸馏水对感染的水果部分进行消毒。用无菌手术刀取侵染果实的部分，无菌转移到配制好的PDA培养基上;30°C孵育72 h ~ 96 h。

纯培养

鉴定和定量的菌落进行了调查和观察在孵化结束。接下来是选择有代表性的菌落并进行继代培养。这一直持续到获得分离株的纯培养物，并在4°C的PDA斜面上保持。

纯分离株的鉴定与鉴定

从菌落形态和细胞形态(宏观观察;菌丝和孢子的颜色，形状和表面纹理)。在光镜下用湿法贴壁法观察其细胞形态。在载玻片上的一滴蒸馏水上，用接种针引入一小部分菌丝，然后用针梳理。加入两滴亚甲基蓝，盖上盖片，在40X物镜下观察成熟果结构的菌丝性质和分布以及不同的性状真菌记录观察到的分离株。然而，各种真菌将分离株与Barnnet和Hunter的病原真菌纲要中的真菌进行比较[10］．

纯真菌分离物的接种制剂

将0.2 g酵母提取物和1 g蔗糖溶解在100 ml蒸馏水中，制备每个纯真菌分离物的悬浮液。将PDA介质在121°C下通过高压灭菌搅拌并消毒15分钟。冷却后，将每一环的真菌分离物接种到无菌瓶中，在25℃机械摇床中培养48 h。

致病性试验

淡水瓜用蒸馏水冲洗，用70%乙醇消毒。从果实中获得直径为4毫米的柱，用无菌软木钻和真菌菌丝(分离株的纯培养)。圆盘用无菌接种环取出，放在果柱中(果柱为圆盘柱)，上面覆盖着水果皮肤然后用凡士林凝胶密封，以防止其他生物污染。然后在30°C下孵育。

科赫假设

从接种后的水果样品中重新分离出病原菌;这是通过无菌刮刀获取一小部分变质水果样品，并直接接种在无菌PDA板上完成的;然后是孵化。得到纯净的培养物;对分离株进行了宏观和微观检查。

敏度盘的制备及接种剂的标准化

直径为6.0 mm的感光盘在160℃下消毒15分钟真菌分离株在PDA培养基中30°C下标准化96 h。72 h后，在酵母浸提液中传代培养，使浊度达到理想标准。在培养箱摇床上培养48 h。

抗菌药物敏感性

用圆盘法筛选植物提取物的真菌毒性扩散使用PDA平板作为接种剂的方法。将试验生物均匀涂抹在浸在不同浓度提取物(250 mg/盘、100 mg/盘、50 mg/盘、25 mg/盘和5 mg/盘)中的培养基和浸渍敏感盘上;控制盘放在中间。培养基在30°C孵育48 h。根据Stockes和Ridgeway [11］．

结果

从侵染西瓜果实中分离出的纯分离株，有三种真菌植物病原菌被分离和鉴定:黄曲霉，链霉菌属种虫害和尖孢镰刀菌（表1)．对这些病原菌进行了真伪鉴定致病性测试。研究了不同浓度(250mg /ml、100mg /ml、50mg /ml、25mg /ml、5mg /ml)植物乙醇提取物的抑菌效果及对菌株的抑制作用链霉菌属sp .已给出表2．

表1:真菌的宏观和微观鉴定。

表2:乙醇植物提取物对在体外抑制链霉菌属spp。

植物乙醇提取物对黄芩菌丝生长的抑制作用病圃均显示在表3并研究了乙醇植物提取物对在体外对黄曲霉进行抑制表4．

表3:乙醇植物提取物对在体外抑制尖孢镰刀菌．

表4:乙醇植物提取物对在体外抑制黄曲霉．

c . odorata叶提取物在250 mg/ml时的抑制作用最高，为16 mm, 5 mg/ml时的抑制作用最低，为13 mm答:籼稻叶片提取物在250mg /ml时的抑制作用最高，为18mm, 5mg /ml时的抑制作用最低，为5mm。两种植物提取物的抑制作用，即c . odorata而且答:籼稻提取物对菌丝生长的影响链霉菌属sp .在不同浓度下有显著差异图1而且2．从表3，答:籼稻叶提取物在250 mg/ml时的抑制效果最高，为22 mm，在250 mg/ml时为19 mmc . odorata而且答:籼稻反对尖孢镰刀菌而两种植物提取物在5 mg/ml时活性最低。从表4，两种植物提取物对黄曲霉的抑制作用均为18 mm, 9 mm和12 mm的抑制作用最低。

讨论

众所周知，病原体在生物中是至关重要的，近年来，不同的研究表明了病原体的负面或副作用。水瓜已知含有较高的水分含量和纤维;这使得生物生长得很快，特别是在某些条件下，如不良的处理，储存方法和其他。从样品分析中，分离出西瓜采后腐病的3种主要致病真菌;病原体是黄曲霉，链霉菌属种虫害和病圃．这些致病生物引起这些收获后腐烂的能力表明，它们在短时间内无处不在。真菌引起的植物致病菌感染往往受到一些因素的影响，例如田间生产方式不当(如过度灌溉和氮肥、缺乏作物轮作和土壤排水不良)以及在收获、储存和包装过程中造成的伤口[12];已知这些致病真菌产生真菌毒素，当摄入可能导致真菌中毒，导致急性或慢性疾病发作，如癌症［7］．真菌属类如白色念珠菌，黑曲霉，链霉菌属spp。黄曲霉属spp。枝孢属种虫害和青霉菌细菌能引起人类过敏。有鉴于此，食用不洁的西瓜可能是危险和有害的。关于病原菌对西瓜的影响已有文献记载。这些真菌可导致主要粮食作物和经济作物产量减少10%至30% [13]，这就需要在收获前和收获后的技术来控制它们[14］．

从目前的研究，乙醇提取物c . odorata而且答:籼稻显著降低了菌丝的生长真菌隔离;这可能是由于生物活性成分的存在，如类黄酮、单宁、木质素、皂苷、类固醇［15］．本研究中植物提取物的抑制作用与Omigie和Agoreyo的研究报告一致[16];他们发现了植物提取物抑制植物病原真菌生长发育的能力。Eunice和Osuji也发现了类似的植物致病菌抑制生物生长的报告[17];他们控制菌核rolfsii用提取物引起椰属cormel腐烂桂皮alata而且Dennetia tripetala．本研究揭示了所发现的植物提取物对西瓜果实中病原菌的抑制作用。这表明该提取物是一种有效的抗真菌剂真菌病原体。这项研究还表明答:籼稻更有效的抗真菌比c . odorata．

结论

为了克服果实收获后感染这一令人担忧的问题，发现针对新靶点的植物化学物质是当务之急。因此,c . odorata而且答:籼稻可能成为一种很有前途的天然抗真菌药物，在制药工业中有潜在的应用价值。研究中的植物提取物(c . odorata而且答:籼稻)可用于抑制西瓜果实采后腐菌，但安全、易得、环保、对人体无毒，应大力推广使用。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

确认

作者要感谢尼日利亚Ogbomosho LAUTECH纯粹与应用生物学系的Julius Oloke教授在研究过程中的贡献。

参考文献

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