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对乙酰氨基酚分子印迹对苯二胺玻碳电极的药物片控制

*通信:

马克西姆Pontie宿主-病原体相互作用研究小组，昂热大学，布雷斯特大学，研究所生物学地址:法国拉雷街4号，法国昂热cedex 9, 49933号电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

我们首次报道了一种基于对苯二胺在玻碳电极(GCE)上电聚合的分子印迹聚合物(MIP)，并致力于在商业化片剂中控制对乙酰氨基酚。利用循环伏安法(CV)和方波伏安法(SWV)电化学技术，建立了一种低成本、可重复性和非常简单的测定片剂中对乙酰氨基酚的方法。一个线性进化MIP传感器的检测限(LOD)为30 μg/L，信噪比(S/N)为3。对乙酰氨基酚和对硝基酚有很好的选择性，多巴胺并对dopac干扰分子进行了验证，回收率在97.4% ~ 101.4%之间，表明所提出的方法用于商业化片剂质量控制的准确性和重复性。

关键字

双氯芬酸检测;碳糊电极;生物降解;Scedosporium；修饰电极;纤维素纤维

简介

各种药物活性化合物(PhACs)(即对乙酰氨基酚，布洛芬，卡马西平，双氯芬酸)经常在污水处理厂的流出物和地表水中检测到，因为消费者使用，医院废物和不当处理。这一发现是科学界一股热潮的起源，旨在开发创新的废水处理工艺，因为用于人类消费的水资源受到污染的风险越来越大[1］．

与对乙酰氨基酚一样，双氯芬酸(DCF)是最常用的非甾体抗炎药之一药物(非甾体抗炎药)2］．它是一种治疗人类和动物的高度常用的药物化合物。不幸的是，DCF还显示出巨大的生物积累潜力和慢性生态毒性，对生物体构成严重风险[3.］．因此，DCF现被列为首个《水框架指令》(WFD)警戒清单中的新兴环境微污染物[4，5］．正如芬兰最近的报道[6),浪费水可能含有高达0.4毫克升^－1phac。

PhACs的生物降解微生物它们已经证明了它们有潜力将这些分子降解为无害的最终产品，如CO₂和H₂O被越来越多地认为是一种环保和低成本的选择。到目前为止，这些有机微污染物的处理浪费水主要是基于细菌群落的作用，但不幸的是，DCF显示低细菌的生物降解性。因此，真核生物的鉴定仍然是一个挑战微生物能够有效地降解PhACs，特别是DCF和相关化合物。在这方面，真菌属于属Scedosporium逐渐成为有吸引力的生物降解剂，因为各种Scedosporium菌株被证明能够使用脂肪族和芳香族碳氢化合物作为碳和能源来源(7-10］．尽管大多数Scedosporium物种对人类来说是机会性病原体物种美国dehoogii从未涉及深部感染[11]，很少与皮下感染有关[12]，使该霉菌成为生物修复目的的一个有前途的候选，正如最近报道的对乙酰氨基酚生物降解(图1）［13］．

此外，在的方法健康风险管理，建议的方法的一部分仍然是开发新的分析工具[1］．DCF浓度的测定通常采用高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管区带电泳法、分光光度法、荧光光谱法和色谱法。此外，电化学方法由于操作步骤简单，设备成本低，成为监测PhACs化合物的重要工具;此外，它们允许相当快的分析，允许实时测量。在这一领域，通常用作传感装置的化学修饰电极尤其令人感兴趣，特别是碳基修饰电极易于制备，价格低廉，通常产生可重复的信号[14］．以前用于DCF电分析的碳糊电极(CPE)制备的碳材料包括碳纤维、碳粉、热解石墨、铅笔石墨、多壁碳纳米管(MWCNT)、石墨烯或石墨粉[15-19］．最近，木质纤维素材料(如咖啡壳)和纯纤维素纤维被成功用于制备对乙酰氨基酚测定专用CPE [20.-23］．它们作为修饰剂的目的是增加修饰电极的实际表面积和亲水性。

在目前的工作中，我们利用了最近开发的纤维素纤维改性CPE [21]阐述了一种专用于DCF分析的伏特传感器，作为测定DCF生物降解的一部分美国dehoogii．

材料与方法

试剂

DCF从Sigma-Aldrich购买为钠盐形式的粉末(批号#BCBV3438)，并在收到时使用。所使用的基础溶液的组成如下:1 L超纯水:5 g (NH₄）₂所以₄；5 mg苯基;0.652 g MgSO₄；二氯兰1毫克;氯霉素0.5 g;0.01 g FeSO₄；1.25 g KH₂阿宝₄．所有水溶液均由分析级化学品制备，使用Elga实验室水超水系统(Purelab- UV-UF, Elga，法国)的无菌去离子水(pH 6.5，电导率< 1 μS cm)^－1TOC < 0.1 mol L^－1)．

微生物及培养条件

五个菌株代表五个突出Scedosporium物种,即。美国apiospermumIHEM 23577,美国dehoogiiUA 110350859 - 01,鲍氏血清IHEM 4595,美国aurantiacumUA 120218507，和美国minutisporumIHEM 23833进行了调查。每周常规在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YPD)琼脂板(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)上传代菌株。

的能力Scedosporium通过在含有DCF的Scedo-Select III琼脂板上培养真菌，研究了以DCF作为唯一碳源的菌株。用15 mL超纯水浸没琼脂表面，在25-30°C的YPD培养基上培养2周，收获分生孢子。获得的真菌悬浮液在40 μm孔径的无菌尼龙过滤器上过滤，滤液经4000 g离心(4℃下5 min)制成孢子粒，在10 mL无菌超纯水中重悬，最后用血细胞计计数。然后将分生孢子接种到Scedo-Select III琼脂板上[24]含有DCF作为碳源。为此目的，a股票配制DCF溶液(0.975 g DCF, 30 mL超纯水，5 mL乙腈)，过滤(0.2 μm孔径无菌膜)灭菌。在培养基中加入DCF，最终浓度为0.9 g L^－1接种分生孢子(10⁴10 μL)， 37℃孵育3周美国apiospermum，鲍氏血清,美国aurantiacum， 25°C美国minutisporum和美国dehoogii．在第6、12、16和21天测定径向生长。为了进行比较，在培养基中使用4-羟基苯甲酸酯(4-HBz)作为唯一碳源进行了相同系列的实验。

DCF降解的研究美国dehoogii使用纤维素修饰的碳糊电极(CPE-Ce)进行，如下所示。将在YPD琼脂平板上培养2周的分生孢子接种到添加DCF作为碳源的酵母提取物蛋白胨(Yeast extracts -蛋白胨，YP)肉汤中。向YP肉汤中加入终浓度为0.9 g L-1的DCF，接种分生孢子(10⁶毫升^－1)，将培养基分到20个50ml的烧瓶中。然后将烧瓶在25±2°C下恒温培养两周(125 rpm)。真菌第3天生长明显。因此，从第4天开始，每天使用2个烧瓶测定DCF的残留浓度。在本工作第一部分优化的条件下，使用线性扫描伏安法CPE-Ce进行测量。对照组在基础培养基中添加DCF，但不接种真菌，在相同条件下孵育。

装置

使用电化学分析仪PG580 (Uniscan Instruments, UK)与个人计算机连接，对溶液中DCF量进行电化学测量。电化学软件为Uniscan Instruments公司的UiEchem 3.27版本。采用了经典的三电极电池结构，包括CPE- ce或未修饰的CPE，银/氯化银参比电极和铂丝对电极。

通过场发射枪扫描电子显微镜(FEGSEM)在JEOL(法国昂热大学的SCIAM通用服务)的JSM-6301F设备上实现了cpe表面的形态分析。每个CPE的1厘米高的圆柱体使用碳胶带固定在SEM样品支架上。获得的图像来自3 keV的二次电子，放大倍率为1000倍。

改性和未改性cpe的制备，测试电极的FEGSEM图像以及真实表面与几何表面的确定

CPE-Ce是通过将30mg硅油与65mg石墨粉(分析级，超F， <325目，来自Alfa)在砂浆和5mg纤维素粉中彻底手工混合制备的。用作CPE改性剂的纤维素从Fluka供应商购买，纤维长度在0.015 mm到0.112 mm之间(批号#345768/1 595)。复合混合物的一部分被塞进特氟龙®管的圆柱孔中，配备有铜线作为与其余电路的电气接触(LD乐动体育官网图2一个)．在使用前，要暴露在溶液中的表面要在称重纸上抛光，以使其光滑。正如文献中广泛报道的那样[14]，我们使用cpe，因为它们低成本和非常容易的再生程序。我们之前对这方面进行了优化，并演示了3条2.5 cm的线是必要的，如图所示图2 b足以使表面完全再生。FEGSEM分析表明，与CPE相比，CPE- ce上存在直径约10 μm的纤维素纤维(图2 c和二维)．

为了评估被测电极的真实表面积，使用5 mM [Fe(CN)]的探针溶液，用循环伏安法比较了CPE- ce和未改性的CPE₆）^{3 -}] 0.1 M磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS) pH 7.42。探针在给定电极上的峰值强度(Ip)可用于根据Randles-Sevcik方程确定该电极的实际表面积(a) [25］．测试了两个电极的几何表面，估计为0.071厘米²，从半径为15毫米的圆的面积计算。相比之下，CPE和CPE- ce的电化学活性表面积由探针[Fe(CN₆）^{3 -}]，使用循环伏安法。CPE和CPE- ce的峰值电流分别为126 mA和198 mA。利用Randles-Sevcik方程，从这些峰值电流计算出实际几何面积为0.075 cm²0.118厘米²，分别为“持续教育课程”及“持续教育课程”而设[22］．

结果及讨论

DCF的电化学行为

为了确定DCF的电活性域，循环伏安法(CV)用于1.5 mg L^－1PBS中的DCF，使用CPE和CPE- ce，从-0.2 V到+0.6 V vs. Ag/AgCl。DCF在cpe下氧化的阳极峰值电位为0.48 V，如图所示图3．这种不可逆的氧化还原系统与一个氧化还原过程相关联，对应于通常观察到的DCF的直接氧化平衡[16]，并在图3 b．

但最近Aguilar-Lira等人。17]表明，DCF在水介质中的电化学氧化，可以涉及一个电子交换反应的EC机制和一个导致氧化产物通过氮原子分解的化学反应，生成2,6二氯苯胺和2-(2-羟基苯基)乙酸化合物。该机制可以解释在0.00 V至0.30 V之间观察到的可逆氧化还原系统的存在(图3)．他们提出了将2-(2-羟基苯基)乙酸电化学还原为1-羟基-2-羟基苯基)乙酸盐，并在pH值7下进行一次电子转移氧化。这些作者使用该氧化还原系统，根据在0.25 (图3)．我们的选择更常见，因为它是基于对峰值电位为0.48 V时的DCF的直接分析。

DCF直接氧化工艺优化

添加纤维素

如图4，随着纤维素纤维的加入，DCF的氧化电流增大。我们之前已经确定了使用纤维素的最佳数量[22，23］．使用CPE- ce与未修改的CPE的峰值强度之比估计为6(结果未显示)。观察到的CPE- ce灵敏度的增加可以归因于由于纤维素纤维的存在而增加的几何表面和/或由于纤维素纤维的添加而增加的CPE外层的亲水性。为了研究每个假设，我们首先用探针确定了真实的CPE表面，遵循电化学传感器开发中的经典方法，如最近报道的[22，23］．按照这种方法，我们用探针Fe(CN₆）^{3 -}几何面积的比率为1.6。我们观察到，这个比例与DCF得到的峰值强度有很大不同，DCF被评估为6。因此，这两个比率之间的差异对应于由于纤维素纤维的加入而对电极的化学修饰的贡献。因此，可以根据电流密度来比较测试的cpe，如中所示图4．

我们最近报道了纤维素纤维的存在改变了碳糊的亲水性[13，22，23］．事实上，通过测量在CPE改性/未改性表面上沉LD乐动体育官网积的水滴的接触角，我们观察到用无柄滴技术测量的接触角分别从109°下降到75°，对于未改性的CPE和CPE- ce [22］．当使用纤维素作为CPE的改性剂时，暴露于DCF的表面的化学变化也导致电流密度增加4.4倍。其他化学作用，如H-H键也可能起作用。然而，我们的结果表明，27%的当前增益是由于几何面积的增加，影响这一过程的主要参数仍然是对DCF的化学亲和性，增益为73%。考虑到所描述的初步结果图4，因此我们选择了纤维素改性的CPE进行进一步的实验。

积累时间的影响

如图5积累时间通过改变DCF在CPE-Ce上的表面浓度，显著影响DCF的直接氧化峰电流。氧化峰电流在300s内随着积累时间的增加而显著增强，之后基本保持不变。这可能是由于CPE-Ce表面建立了DCF浓度平衡。这说明实际几何面积的增加(如上估计)严重影响了堆积效率。在此基础上，后续研究选择250 s为最佳积累时间。然而，重要的是要提醒，与其他积累条件相比，初始电位仍然是影响伏安反应的主要因素，正如Yang等人报道的[19]用于DCF分析，由Sbai等人进行。[26]用于甲基对硫磷分析，使用碳基修饰的超微电极。

初始势的影响

氧化峰值电流在- 0.4 V时达到最大值，如图所示图6．此外，正如Yang等人报道的那样，观察到正电位的峰值强度急剧下降。[19] mwnt - dhp薄膜涂层的GCE。改性电极的电荷状态直接影响DCF的吸附和氧化，涉及电子和质子的转移。在最大峰值强度下确定了- 0.4 V的最佳初始电位。

CPE-Ce在DCF生物降解研究中的应用Scedosporium物种

选择Scedosporium物种

以估计的能力Scedosporium物种来代谢DCF，这是五个突出菌株的代表Scedosporium物种包括鲍氏血清，美国apiospermum，美国aurantiacum，美国dehoogii,美国minutisporum在Scedo-Select III培养基上辅以DCF (表1)．

表1。几种培养基的径向生长时间和倍增时间(t1/2)Scedosporium物种镀到Scedo-Select III培养皿中，辅以DCF作为唯一的碳源。

为了比较生长的半衰期Scedosporium物种在测试中，数据首先在0和1之间标准化。利用“Hill-like”方程(1)对这些数据进行分析:

直径是菌株的直径，在培养皿中测量(径向生长)，t是培养的时间(天)，t_1／2为培养物50%生长的时间，n为描述生长曲线s型的«表观希尔数。将生长速率与在含有4-羟基苯甲酸酯的经典Scedo-Select III培养基上观察到的生长速率进行比较[24］．

在scido - select III琼脂混合物中加入4-HBz或DCF，最终浓度为0.9 g L^－1分生孢子(104个，10 μL)接种，平板于37℃孵育21 d美国apiospermum，鲍氏血清,美国aurantiacum， 25°C美国minutisporum和美国dehoogii．分别于第6、12、16、21天测定菌丝体径向生长情况。如表1，美国dehoogii在添加DCF为唯一碳源的Scedo-Select III培养基上培养，其生长速度更快。有趣的是,这物种就对人类健康的风险而言，可能是问题最小的，正如Blasi等人最近讨论的那样。[9］．Scedosporiumdehoogii因此被选为后续实验。

CPE-Ce的校准图和生物降解研究

线性扫描伏安法(LSV)使用CPE-Ce在0.2 mg ~ 2.5 mg L的基础溶液中进行^－1(在2.5 mg L的饱和度下^－1在25°C)。改进后的CPE-Ce上DCF的校准图从0.25 mg L开始呈线性^－1至2.5 mg L^－1．DCF的氧化遵循方程y = (28.3x + 21.2)，其中y是峰值电位时测量的峰值电流(单位为A)， x是DCF浓度(单位为mg L^－1)，用线性回归法确定检测限(LOD)。相关系数(R2)为0.999。

表2提供了文献中不同修饰电极和不同分析参数测定DCF的结果比较[15-19，27-29］．这项比较研究表明，目前的传感器比一些早期报道的方法的可接受性，特别是在LOD方面。这可能归因于固定随着CPE表面表面积的增大和CPE表面润湿性的变化，CPE表面的纤维素纤维数量增加。

表2。不同改性电极测定DCF的分析性能比较。

为了评估其分析适用性，将所提出的DCF传感器应用于1.75 mg L的制备溶液的测定^－1，经此方法估计为1.79 mg L^－1(回收率103%)。的真菌接种液与2 mg L混合^－1将DCF倒入20个烧瓶中，连续搅拌12天。从第2天开始，测定培养基中DCF的残留浓度电化学在CPE-Ce传感器上使用优化的CV参数进行分析。图7显示了时间进程进化DCF浓度。

DCF浓度随时间成比例下降(图7)，而真菌质量。这证明了真菌对DCF的降解及其作为碳源的使用。进一步得到ln (DCF/DCF . ln /DCF . ln)之间的线性关系_{t = 0}，表明降解过程受伪一级动力学控制(见式(2):

DCF的动力学常数k和半衰期分别为0.012 d^－1初始浓度为1.65 mg L时为57.8天^－1温度为25°C。

研究了DCF的生物降解途径Scedosporium物种完全未知。然而，以前的工作揭示了各种生物转化途径可能发生在微生物（图8)．这特别意味着单加氧酶的不同酶的干预家庭与5-羟基dcf的对苯醌亚胺衍生物一起形成单羟基和双羟基dcf代谢物[30.］．最近，在森林土壤微生物群落完全降解DCF的过程中，Facey等人[31通过LC-MS/MS-TOF鉴定出一种羧化双氯芬酸中间体。这可能是一个关键的中间体，可以使双氯芬酸通过2,6-二氯苯胺和羧化的2-羟基苯乙酸分别通过2-氯马来酰乙酸和4-马来酰乙酸进行完全生物降解(图8)．当然，还需要进一步的实验来破译DCF在体内的完整分解代谢途径Scedosporium物种。

结论

本研究提出了一种新型纤维素纤维改性CPE，并优化了DCF电分析性能。首次用该方法测定了DCF生物降解的动力学参数Scedosporium物种。本研究显示了利用纤维素粉增加未改性CPE的几何面积和亲水性的潜力。最佳积累时间为250 s，初始电位为0.4 V/Ag/AgCl/Cl-。在著名的Scedosporium物种，我们证明了这一点美国dehoogii当DCF作为唯一碳源存在于培养基中时，表现出最佳的代谢能力。这一观察结果引导我们实验了由改进的CPE和组成的生物电化学系统的DCF生物降解潜力美国dehoogii．这使我们能够观察到动力学顺序为1，动力学常数k(25°C)为0.012天-1天半时间为57.8天，初始浓度为1.65±0.05 mg L^－1．进一步的研究通过使用纳米纤维纤维素(NFC)来改善这一过程，以增加表面积，从而可能提高CPE-Ce的灵敏度。我们还将测试将电化学分析与其他分析方法(即LC/MS)相关联的可能性，以破译DCF在体内的分解代谢途径美国dehoogii．

确认

作者要感谢Romain Mallet (SCIAM，昂热大学，法国)为我们的cpe提供FEG-SEM图像，Thomas GUILLEMETTE (IRHS，昂热，法国)，Hervé GAILLARD (ENSC普瓦捷，法国)和Didier HAUCHARD (ENSC雷恩，法国)进行了富有成效的讨论。特别感谢Yordina GOVINDEN(2014年昂热大学硕士研究生)在群分析和过程(GA&P)团队中获得的DCF电分析的第一个结果。

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