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使用非靶向代谢组学方法研究智障障碍的尿代谢物差异

*通信:

Suvidya Ranade化学系，生物化学Savitribai Phule浦那大学，印度马哈拉施特拉邦浦那电话:020 - 25691728;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

智力障碍(ID)是一种以认知迟缓为特征的疾病。先天性代谢错误是ID的一个重要亚组，目前已有多种治疗方法。我们的目标是使用非靶向的超性能液体从智力残疾儿童中识别遗传性代谢障碍的潜在尿液生物标志物色谱法与质量耦合光谱学(UPLC-MS)代谢组学方法。所有患者都有ID，智商低于70，没有可识别的症状。在ID队列中已经确定了11种化合物上调，其中3种之前报道过，即多巴胺、戊二酰甘氨酸和Suberic acid。讨论了这些标记的生理意义。总之，本研究结果表明，使用先进的高通量分析技术对ID进行尿代谢物分析可能是实现多种代谢缺陷早期诊断和治疗的重要工具，并反映潜在的代谢缺陷生物学的ID。

关键字

质谱法;代谢疾病;代谢组学;验尿

简介

代谢组学是一种强大的技术，用于全面评估全球低来自生物样品的分子量代谢物。它已显示出极大的促进潜力生物标志物发现区分患病和非患病患者。体液代谢物谱分析已被用于改善疾病的诊断、预后和治疗[1］．代谢物是细胞过程的最终产物，是蛋白质和酶活性的直接结果。因此，它们更接近表型或疾病，而不是遗传或蛋白质组学信息。它可以被称为人类代谢组的完整目录[2］．

智力障碍是指一组以认知功能严重受损为特征的发育状况，这些状况与学习、适应行为和技能方面的限制有关[3.］．它影响了1%到3%的人口[4］．它是一种复杂的、多变的、异质性的疾病。病因多样，诊断在世界范围内都是一个艰巨的挑战。代谢状况是ID的一个重要亚组[5］．先天代谢错误似乎是发育迟缓或智力障碍的罕见原因。在已发表的报告中，可识别的代谢障碍导致ID的患者比例从1%到5%不等[6］．在一项系统的文献综述中，共报道了81例以智力残疾为主要特征的“可治疗的先天性代谢错误”，包括氨基酸、胆固醇和胆汁酸、肌酸、脂肪醛的紊乱;葡萄糖体内平衡和运输;半胱氨酸;溶酶体、金属、线粒体、神经传递;有机酸、过氧化物酶体、嘧啶、尿素循环和维生素/辅因子[7］．

全球代谢组学是基于对从健康(对照)和患病个体获得的生物样本中的代谢物进行无偏倚定量分析，目的是确定内源性代谢物的差异[8］．非靶向代谢组学方法旨在同时测量生物样本中尽可能多的代谢物，提供长范围的化合物，以识别潜在的生物标志物。尿液样本的整体代谢物谱可以捕捉生物化学网络和途径中的整体变化和整体生理状态，这可能是一种有前途的方法来识别疾病的生物标志物。生物标志物代谢物可作为治疗靶点[9］．由于分解代谢过程，尿液提供了从体内排泄出的极性代谢物的模式。它是一种有用的疾病诊断介质，因为它具有各种优点，包括非侵入性样本收集，易于重复样本和不受容量限制。尿液分析更容易的样品制备，由于样品的复杂性较低，因为低蛋白质和肽水平。作为一个浪费产品，尿液反映代谢失调，并提供了对疾病过程反应变化的见解[10］．

UPLC-MS是生物液体代谢组学领域新兴的高通量强大工具。它使用更小的颗粒、速度和峰值容量，从而在一次运行中提高数百种代谢物的分辨率、灵敏度和分析速度[11］．目前还没有关于ID儿童尿液标志物检测的有效方法学报道，用于检测先天性代谢错误，这可能有助于相关代谢障碍的治疗[12-25］．

研究目的

本研究的目的是开发一种基于非靶向UPLC-MS的代谢组学方法，并进行多变量分析，以筛选和识别尿液代谢变化在智障儿童中。该研究的重点是全球代谢物分析方法的优化和验证，以识别相关和假定的生物标志物。

材料与方法

化学品和试剂

HPLC级乙腈和甲酸从美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司获得。水是由TKA Smart2Pure超纯水系统(TKA，德国)生产的。所有其他使用的化学品均为HPLC级。

受试者和同意

研究的细节向参与儿童的家长或监护人和学校代表解释，并获得书面知情同意。患者样本来自马哈拉施特拉邦浦那的Kamayani智障学校。10名有ID的参与者(n=10;男性:5名，女性:5名)和对照组(n=10名，男性:5名，女性:5名)被纳入研究。患者的入选标准为年龄(9-13岁)，智商低于70分，适应功能不足，定义为ID。临床数据来自所有先证者，包括患者姓名、年龄、性别、智商分数、癫痫以及其他已知的神经精神疾病。在临床医生的指导下，无任何可识别综合征的儿童被纳入研究，作为无综合征队列。儿童没有服用任何类型的药物，可以改变尿液中分泌的代谢物。研究中的对照组受试者来自同一地理区域的一所学校，没有接受任何特殊的饮食或药物治疗。为避免年龄和性别对代谢谱的影响，将健康对照队列中的受试者与ID队列中的相应受试者进行匹配。

尿液样本的制备

在无菌尿液容器中随机收集尿液样本。添加叠氮化钠(0.05% w/v)以防止细菌污染。样品在4°C下以10000 rpm离心10分钟以去除任何颗粒。将上清液转移到2 mL聚丙烯管中，用水1:4稀释，取3 μl转移到相应的LC小瓶中进行进一步分析。

UPLC-MS条件

使用1290 Infinity UHPLC系统，1260 Infinity Nano HPLC with Chipcube, 6550 iFunnel Q-TOF (Agilent technologies, USA)。详细的设置优化了仪器的操作和参数协议都在表1．

表1:UPLC-MS条件下的尿液代谢物分析。

数据处理与分析

使用Agilent MassHunter工作站数据采集软件收集数据，并使用Agilent MassHunter定性分析软件(Agilent Technologies, CA, USA)进行处理。所有原始数据。d文件被转换为复合交换格式文件(. cef)，并导入到质量分析器专业(MPP)软件(Agilent Technologies, CA, USA)进行分析。利用MassHunter工作站软件中的分子特征提取器(MFE)算法进行数据挖掘。实验分组是根据健康(对照组)和患者(患病)的参数分别将患者分为两组。第一个过滤器(丰度过滤)在5000次计数时设置为最小绝对丰度，以拒绝低强度数据。所有少于这个丰度的实体都被认为是噪音。频率的第二个过滤器选择在所有样本中至少50%存在的实体。主成分分析(PCA)是一种算法，用于检测数据中的主要趋势，并通过检查实体的值进行样本质量控制检查。统计分析采用了无配对t检验和Benjamini-Hochberg多重检验校正，根据两组间化合物丰度的显著差异进行实体筛选。使用具有统计学意义的阈值(折叠变化值大于2.0,p值小于0.05)提取潜在代谢物标记物。 METLIN Personal Metabolite Database was used for the identification of endogenous and exogenous metabolites. The structure and functional information was then obtained by searching freely accessible database of HMDB (The Human Metabolomic Database), KEGG (Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomics) and HMP (Human微生物组数据库项目)。

结果

20名受试者、10名患者和10名对照组顺利完成了研究。多种代谢产物被成功检测和鉴定，包括多肽，脂质和小分子。为了研究健康志愿者与患者之间代谢表达信号的差异，首先对ESI阳性模式下的数据集进行主成分分析。从主成分分析中获得的得分图用于所有尿液样本的无监督模式分析(图1)．在评分图中，聚类不清楚，PCA在患者和健康对照组之间没有显示出任何明显的分离。但部分ID组患者代谢谱发生明显变化，提示存在明显的生化扰动。潜在代谢物标记物提取采用统计学意义显著的阈值，即折叠值大于2.0,p值小于0.05(未配对t检验)，由PCA构建。

代谢分析显示，在健康对照组和ID患者之间，共有101种代谢物表达不同。进一步MPP分析发现，在所鉴定的代谢物中，有11种代谢物的表达水平存在显著差异。其代谢产物及其调控概述见表2．UPLC-MS平台可为这些潜在生物标志物的鉴定提供化合物名称、准确质量、保留时间、CAS号、注释和调控信息。

表2:在健康和患者队列中差异表达的代谢物。

在这11种差异表达的代谢物中，其中3种较早被报道与先天性代谢错误以及智力障碍有关。这些代谢物及其功能的列表在表3．

表3:据报道，尿液中代谢物升高与不同的先天性代谢错误以及智力障碍有关。

讨论

在ID患者中发现11种代谢物上调。这些化合物是在正常人类尿液样本中发现的。其中5种与任何特定疾病无关。1-甲基-5-咪唑油乙酸是已知的组胺代谢物。赤藓酮-1,4-内酯已被鉴定为正常成人和新生儿尿液中的tetronic acid内酯。o -乙酰丝氨酸是一种酰基化氨基酸衍生物，产生于肠道微生物代谢或通过食用含有o -乙酰丝氨酸的食物。Orinapterin是一种在人类尿液中发现的生物蝶呤的三对映体。6-羟基多巴胺是一种存在于人类尿液中的天然胺。

磷酸肌酸是一种磷酸化的肌酸分子，在骨骼肌和大脑中作为一种可快速动员的高能磷酸盐储备。据报道，当尿液中升高时，嗜酸性食管炎。琥珀酰丙酮是一种酪氨酸代谢物，是一种遗传性代谢障碍型酪氨酸血症的特异性标志物。然而，它的主要影响是肝肾功能障碍，与智力障碍无关。丙二酰肉碱是一种代谢物，被发现在丙二酰辅酶a脱羧酶(EC 4.1.1.9)缺乏症(OMIM 248360)中积聚在血液中，通常出现发育迟缓。在人类尿液中有报道，但其水平升高的影响尚未报道(HMDB)。总共有三种化合物，即多巴胺、戊二酰甘氨酸和亚硫酸，已被报道与发育迟缓有关。

多巴胺是儿茶酚胺的一种家庭在大脑中，是肾上腺素和去甲肾上腺素的前体。多巴胺在体内首先通过酪氨酸羟化酶使氨基酸酪氨酸多巴水化而合成，然后由芳香- l -氨基酸脱羧酶将其脱羧。(PubChem CID: 681)芳香族l -氨基酸脱羧酶(AADC)缺乏(OMIM 608643)，尽管缺乏多巴胺患者体内的多巴胺并表现为智力迟钝。Wassenberg等人解释了这背后的原因。12]是aadc缺陷患者肾脏剩余aadc活性和l -多巴底物可用性病理增加的结合。认知缺陷和神经病理学表明有缺陷神经传递在中枢神经系统可能导致智力障碍[13］．

戊二酰甘氨酸是一种酰甘氨酸(PubChem CID: 23592950)。酰基甘氨酸是氨基酸和脂肪酸代谢的正常中间体。然而，在浓度升高时，它们是几种先天性代谢错误的生化标记。戊二酰甘氨酸参与赖氨酸代谢(HMDB)。戊二酸血症1型(OMIM 231670)是一种由于线粒体戊二酰辅酶a脱氢酶缺乏而导致机体无法分解赖氨酸、羟赖氨酸和色氨酸的遗传性疾病。过量的中间分解产物(戊二酸、羟戊二酸、戊二酸和戊二酰甘氨酸)积累并对大脑造成损伤，特别是基底神经节，造成不可逆的神经损伤。这些中间产物在尿液中被发现升高，作为识别疾病的潜在生物标志物。延误治疗会使病人病情恶化，导致严重的智力迟钝。

亚戊酸，也叫辛二酸，是一种二羧酸(PubChem CID: 10457)。它是由油酸衍生的代谢分解产物。在脂肪酸线粒体疾病患者的尿液中检出亚酸[18］．据报道，在中链酰基辅酶a脱氢酶缺乏症患者的尿液分析中，亚酸大量排泄[19］．中链酰基辅酶a脱氢酶(EC 1.3.8.7)是参与线粒体脂肪酸氧化的酶之一，它为肝脏生酮提供燃料。缺乏这种酶会导致不完全的β -氧化，导致尿液中亚硫酸含量增加。中链酰基辅酶a脱氢酶缺乏症;OMIM 607008)是人类最常见的线粒体脂肪酸b-氧化遗传疾病。与MCADD相关的各种发育障碍包括智力障碍，脑瘫还有自闭症谱系障碍。

文献提示，代谢试验的可变诊断率在0.8 ~ 13%之间。然而，先天代谢错误是与ID相关的遗传缺陷中最大的一类，可接受因果治疗[20.］．如果不及早发现，至少50%的儿童将经历代谢危机，高达10%的幸存者将发展为严重的发育障碍。有报道称，使用UPLC-TOFMS对尿样代谢谱分析进行了方法验证[21-25］．虽然目前还没有报道使用uppcms技术对全球尿液代谢物进行分析，以确定与智力残疾相关的先天性代谢错误。

结论

我们的研究结果表明，尿代谢物可能使ID患者与正常人分离，并可能反映潜在的疾病生物学ID，这在很大程度上仍然未知。在更大的人群中进一步验证该方法和参数可能会为ID的病因学提供新的直觉，并有助于通过非侵入性技术将尿液代谢物作为生物标志物进行识别。

确认

本研究由大学教育资助委员会-有卓越潜质大学资助[UGC-UPE 262 (B)(2)]资助。我们感谢马哈拉施特拉邦浦那的Kamayani智障学校，他们为研究患者提供和照顾。我们感谢SAIF(尖端分析仪器设施)，印度理工学院孟买为UPLC-MS运行和MPP数据分析。

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