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荧光与同步荧光光谱法研究氟苯尼考与牛血清白蛋白的相互作用。

梦萌C，宝生L^＊、童童L、少童D

河北大学化学与环境科学学院，中国

*通信:

宝生L(河北大学化学与环境科学学院，河北省分析科学与技术重点实验室，河北保定071002电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

通过荧光光谱和同步荧光光谱研究了氟苯尼考与牛血清白蛋白在不同温度下的相互作用机理。这两种方法表明氟苯尼考可导致牛血清白蛋白的荧光猝灭。荧光猝灭的过程称为静态猝灭。静电力结合氟苯尼考和牛血清白蛋白。结合常数的数量级达到104。结合位点约为1。这两种不同的荧光光谱可以得到相同的结论。

关键字

荧光光谱;牛血清白蛋白;Florfenicol;相互作用机理

简介

Florfenicol [1]是氯霉素中的一种新型广谱抗生素，专门用于动物。氟苯尼考于1979年由先灵葆雅公司发现，是一种30氟化的硫霉素衍生物。由于其广谱抗菌活性，氟苯尼考吸引了合成有机化学家的极大兴趣[2］．氟苯尼考的化学结构示于图1．与同类氯霉素和硫霉素相比，氟苯尼考的抑菌活性更高，且无诱导再生障碍者的潜力贫血此外，氟苯尼考由于不含硝基，毒性较小，已被认为是潜在的替代品，因此在兽医中广泛使用医学近年来[3.］．氟苯尼考已在几个国家上市，主要用于猪、牛、家禽和鱼的治疗。因此，开发能够监测其在动物体内主要代谢物的敏感可靠的分析方法具有重要意义。

因为药物-蛋白质相互作用可能导致稳定的蛋白质-药物复合物的建立，这对药物在血流中的分配、游离浓度和代谢有重要影响，有助于了解蛋白质结构之间的关系。白蛋白最重要的功能是作为许多外源化合物的贮藏蛋白和转运蛋白[4，5］．牛血清白蛋白由一个含有585个氨基酸残基的多肽链组成，其中有三个α-螺旋结构域(I-III)，每个结构域包含两个子结构域(a和B)。它有两个色氨酸残基(Trp-134和Trp-212)具有固有荧光。因此，研究白蛋白与蛋白质的相互作用是可能的药物使用荧光光谱学［6］．白蛋白是血浆中含量最多的载体，可与多种内源性和外源性化合物结合，是重要的靶分子和载体药物在生物体中发挥作用。常规荧光光谱学研究了小分子的反应机理药物而蛋白质，主要是通过研究加入药物前后蛋白质在最大发射波长处的荧光强度变化，推导出蛋白质与药物之间的结合常数、结合位点、给受体距离等信息。同步荧光光谱法该技术最早由Lloyd提出，与荧光测量法最大的区别是激发单色仪和发射单色仪同时扫描。与常规荧光光谱法相比，同步荧光法具有选择性好、灵敏度高、干扰小等优点，可用于多组分混合物的同时测定。这种研究方法也可用于氟苯尼考与牛血清白蛋白相互作用的研究。

实验

装置

用岛津RF-5301PC荧光分光光度计记录荧光光谱。圆二色谱记录在MOS-450/SFM300圆二色谱仪(Bio-Logic，法国)上。吸收光谱用紫外-可见记录分光光度计(UV-265，岛津，日本)测量。所有pH值测量均使用pH - 3c精密酸度计(中国上海莱奇)进行。所有温度均由CS501过热水浴池(南通科学仪器厂)控制。

材料

氟苯尼考纯度次之，为98.5%。牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司，纯度等级低于99%。股票利用ε280 nm= 43800 M的分子吸收系数，用分光光度法测定了牛血清白蛋白(10 μM)的浓度^－1厘米^－1［7］．的股票制备了FRF (100 μM)溶液。使用含NaCl (0.15 M)的Tris-HCl缓冲溶液使溶液pH保持在7.40，使用NaCl溶液保持溶液的离子强度。化学试剂均为分析级，实验全程使用双蒸馏水。所有水溶液保存在277 K。根据激发光的吸收和发射光的再吸收修正了荧光强度，以使用以下关系减少内部滤光片[8]：

F_天哪= F_{奥林匹克广播服务公司}×e^{(Aex + Aem成分股)/ 2}(1）

F_天哪和F_{奥林匹克广播服务公司}分别为校正后的荧光强度和观测到的荧光强度，A_前女友和一个_新兴市场分别为激发波长和发射波长处频响的吸光度值。本文使用的荧光强度为校正后的荧光强度。

实验程序

1.0 mL Tris-HCl (pH=7.40)， 0.3 mL BSA溶液(1.0 × 10⁵M)和不同浓度的FRF依次加入到10ml比色管中。用双蒸馏水将样品稀释至成比例体积，摇晃充分混合，在不同温度(298 K、303 K和310 K)下静置30 min，进、出孔均设为5 nm。激发波长分别为280 nm和295 nm，单元路径长度为10 mm。溶液随后在荧光光度计上扫描得到发射光谱。为了记录BSA-FRF体系的同步荧光光谱，设置Δλ值为15 nm和60 nm。Δλ表示激发波长和发射波长之间的不同值。

结果与讨论

BSA-FRF体系的荧光光谱分析

BSA是一种由于氨基酸的存在而具有内源性荧光的蛋白质，主要是色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)。以一定浓度的BSA为研究对象。在此基础上，可以理解和分析BSA-FRF系统的相互作用机制。根据实验程序，可以记录和绘制BSA-FRF体系的荧光光谱。结果显示在图2．随着FRF浓度的增加，BSA在340 nm处的荧光强度不断降低，说明FRF猝灭了BSA的荧光。为了研究BSA-FRF的相互作用机理，根据Stern-Volmer方程对实验得到的淬火数据进行处理[9]：

（2）

在那里,K_sv是Stern-Volmer淬火常数K_问为淬火速率常数，[Q]为淬火剂浓度。F₀和F分别表示不存在猝灭剂和存在猝灭剂时的荧光信号。τ0为不含猝灭剂的荧光平均寿命，约为10⁸s.根据Eq. 2，根据F0/F与[Q]的线性拟合图，K . s_sv可获取值。结果显示在表1．

表1。FRF和BSA在不同温度下的淬火反应参数。

动态淬火过程与扩散有关。随着温度的升高，扩散系数变大，使整个体系的淬火常数增大。静态猝灭是一个形成静态化合物并改变整个体系荧光的过程。温度的升高会引起化合物稳定性的下降，因此静态淬火速率会有一定程度的下降[10］．在表1，猝灭常数随温度升高而有序降低，说明BSA-FRF系统的相互作用机制可能为静态猝灭过程[11］．在FRF与BSA分子的强相互作用中产生新的稳定化合物。新的化合物可以储存和运输。另外，K的所有值_问均远大于各种淬火剂的最大散射碰撞淬火常数值(2 × 10¹⁰米^－1年代^－1)，进一步说明FRF对牛血清白蛋白荧光的猝灭机制不是由动态碰撞引发的，而是由络合物的形成[12］．

绑定常数的计算

对于静态猝灭，通常可以用式3描述荧光强度与猝灭剂浓度之间的关系，从而得到结合常数(K_一个)及浏览网站数目(n) [13]：

lg[(F0-F)/F]=n·lg[L]+lg Ka (3)

式3中，Ka和n分别代表结合常数和结合位点数。[L]为游离药物浓度。然而，药物的真实游离浓度很难确定。因此，药物的总浓度往往会取代药物的实际游离浓度。但这将影响实验结果的准确性。因此，计算式4 [14]，据此可计算生物大分子与小分子相互作用的结合常数和结合位点数。

（4）

其中[Dt]和[Bt]分别为FRF和蛋白质的总浓度。假设括号内n = 1，画出log(F0/F-1)与log{[L]-n(1- f /F0)[Bt]}的曲线并进行线性拟合，则n的值可由该图的斜率得到。如果n的值不等于1，则将其代入括号，并再次绘制log (F0/F-1)与log {[Dt]-n(1- f /F0)[Bt]}的曲线。这一过程反复进行，直到得到n的单个值。在得到n的值的基础上，得到绑定常数K_一个也可以确定。根据所开发的简单程序，用计算器进行计算，将F、[Dt]和[B的值代入即可得到结果_t］．结果显示在表1．结果表明，在不同温度下n均近似等于1，说明BSA中仅存在一个FRF结合位点。在表1，结合常数Ka大于103，说明FRF与BSA之间存在较强的相互作用。温度变化对结合位点数目n的影响不大。因此，BSA与FRF之间存在稳定的结合力。在血液中，血清白蛋白可以储存和运输FRF。随着温度的升高，K_一个BSA-FRF体系的强度越来越小，说明形成的化合物的稳定性随着温度的升高而下降。在BSA-FRF系统中，再次确定静态淬火过程[14］．

结合位点的确定

当λex=280 nm时，可以同时激发BSA的Trp残基和Tyr残基的荧光。当λex=295 nm时，只有色氨酸残基的荧光能被激发[15］．在牛血清白蛋白三级结构中，色氨酸残基主要位于牛血清白蛋白子结构域的IB区和IIA区。而Tyr残基主要分布在IB、IIA和IIIA区域。因此，在BSA的疏水子域中，小分子配体的结合位点主要位于IB区(Trp135, Tyr138, Tyr140, Tyr148, Tyr150, Tyr160)， IIA区(Trp214, Tyr263)和IIIA区(Tyr401, Tyr411, Tyr497) [16］．为了了解Trp和Tyr残基在BSA-FRF体系中的参与情况，并确定具体的结合位置，基于“Stern-Volmer方程”，比较了BSA-FRF体系(λex=280 nm)与(λex=295 nm)的荧光光谱。如图所示图3， 280 nm和295 nm激发的BSA猝灭曲线不重叠。BSA在280 nm处的猝灭程度远大于295 nm处。这一现象表明，色氨酸残基和酪氨酸残基都参与了FRF与BSA的相互作用。另外，结合常数(λex=280 nm)明显大于结合常数(λex=295 nm)，进一步说明Trp和Tyr残基都参与了BSA-FRF体系的反应。因此，可以推断BSA-FRF系统的结合位点位于子域的IIA区域。

BSA-FRF系统的同步荧光光谱分析

同步荧光光谱可以反映发光基团分子的微环境。不同的激发波长和发射波长的差值说明不同光谱学属性。对于BSA，当Δλ=15 nm时，只有光谱学可以显示Tyr残基的性质。当Δλ=60 nm时，只有光谱学色氨酸残基的性质可以显示[17］．通过晶体结构研究可知，牛血清白蛋白分子二级结构中包含三个α-螺旋结构域(I、II和III)。每个结构域可分为两个子域(A, B) [18］．有三个组合部件药物在BSA上，一个位于子结构域IIA区(含有Tyr和Trp残基)，两个位于IIIA区(含有Tyr残基)[19］．为了检测FRF对牛血清白蛋白构象的影响，我们固定了FRF的浓度，逐渐增加FRF的浓度。然后扫描并记录BSA-FRF体系的同步荧光光谱，如图所示图4．它可以从图4，加入FRF后，Tyr和Trp残基的荧光逐渐淬灭，荧光峰位置分别红移2 nm、5 nm。荧光光谱的变化说明BSA构象发生了变化[20.］．也就是说，BSA与FRF的相互作用改变了Tyr和Trp残基的微环境，极性增加，疏水性降低，多肽链拉伸，BSA结构松动[21］．因此，Trp和Tyr残基都参与了反应，IIA子结构域区域是结合位点。同步荧光光谱数据按式2和式4处理。研究结果载于表2．n的值约为1。Ka值随着温度的升高而减小，表明淬火过程为静态淬火。表1而且2而且图3验证了传统荧光法得到的结论光谱法与同步荧光光谱测定结果一致。

表2:FRF和BSA在不同温度下的淬火反应参数。

BSA-FRF系统中相互作用力的类型

生物大分子与药物小分子的相互作用力主要包括氢键、疏水力、范德华力、静电力[22］．牛血清白蛋白与牛血清白蛋白相互作用力类型药物药品差异的变化。已知BSA-FRF体系的淬火过程为静态淬火。因此，可以将不同温度下的Ka代入热力学公式[23］．从热力学参数可以判断BSA-FRF体系的相互作用力类型。当温度变化范围很小时，ΔH可以认为是常数。热力学参数可根据van 't Hoff方程计算[24]：

（5）

(6）

(7）

式中ΔH和ΔS分别为结合过程的焓和熵的标准差。R为气体常数(R=8.314 J mol^－1K^－1)．T是热力学温度。从热力学的角度来看，ΔH>0和ΔS>0意味着疏水相互作用。ΔH<0和ΔS<0反映范德华力或氢键的形成。ΔH<0、ΔS>0表示静电力[25］．根据式5-7和不同温度下的结合常数Ka，可以得到各温度下ΔH， ΔS和ΔG的值，分别列在表3．

表3:研究了不同温度下FRF-BSA的热力学参数。

是否自发反应取决于ΔG的值。ΔH的减少和ΔS的增加都有助于自发反应。ΔG为阴性暗示了BSA和FRF之间的自发反应。从表3， ΔH<0和ΔS>0说明静电吸引在整个系统中起了重要作用。同步荧光法得到的结论与传统的荧光猝灭法一致。ΔG在Δλ=60 nm时计算的λex小于λex为280 nm时计算的λex，说明Δλ=60 nm时的自发程度更大。这体现了同步荧光光谱学具有比传统荧光光谱更高的灵敏度。

结论

本文通过两种不同的荧光光谱研究了BSA与FRF在不同温度下的相互作用。两种方法使用相同的方程处理数据，在猝灭机理、相互作用力类型、频响对牛血清白蛋白构象的影响等方面得出了相同的结论。结果表明，FRF通过静态猝灭的方式使牛血清白蛋白的荧光猝灭。静电吸引是粘结过程的主要动力。在牛血清白蛋白分子中，Tyr和Trp残基都参与了反应。同步荧光光谱学具有较高的灵敏度，可广泛用于药物与蛋白质反应机理的研究。

确认

本文作者在此感谢中国国家科学基金资助项目(no.;21375032)。

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