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科特迪瓦冈比亚按蚊对氨基甲酸酯类和有机磷类杀虫剂的抗性现状及其对疟疾病媒控制的意义DÃⅱÂ Â

*通信:

图雷Mahama， UFR environment, Université Jean Lorougnon Guédé， BP 150 Daloa, Côte科特迪瓦，电话:+225 32 78 20 38;电子邮件:(电子邮件保护)

摘要

本次调查于2012年2月至5月在科特迪瓦的8个地点进行。它的目的是调查田间抗性水平冈比亚疟蚊人们对氨基甲酸酯类和有机磷类杀虫剂的使用，考虑到这些杀虫剂与拟除虫菊酯类杀虫剂在杀虫剂处理过的蚊帐基础上进行疟疾病媒控制的可能性。

使用两种氨基甲酸酯进行的生物测定显示，仅在zuouan - hoounien使用0.4%的恶虫威，在Tiassale使用0.1%的残杀威，死亡率很高;99%和91%。使用有机磷后，只有在左-霍恩地区的蚊子再次显示出高死亡率(100% - 1%)。相比之下，使用0.4%的甲基毒死蜱时，研究地点的蚊子死亡率很高。

调查G119S突变显示,抗性等位基因的频率(ace-1R)字段疟蚊的数量很低,从0变化在布瓦凯Zouan-Hounien 0.52 (Yaokoffikro)。所有群体的Hardy-Weinberg平衡或不平衡均显示Fis (W&C) <0，表明在ace-1位点上杂合个体的系统性超过。

的低ace-1R在甘比亚拟单胞菌田间的分布频率表明G119S突变并不是Côte科特迪瓦对氨基甲酸酯和有机磷酸盐产生抗性的主要机制。

关键字

冈比亚疟蚊;杀虫剂;矢量控制;疟疾;科特迪瓦

简介

疟疾由按蚊传播，是世界上最具挑战性的公共疾病之一健康问题。自2000年以来，在防治疟疾方面取得了重大进展。根据最新估计，2000年至2015年期间，疟疾病例发病率降低了41%，疟疾死亡率降低了62% [1］．尽管取得了显著进展，但疟疾继续对人们的健康造成毁灭性影响健康和生计。最新估计显示，2015年全球发生2.12亿例，导致42.9万人死亡，其中大多数是非洲5岁以下儿童。

一般而言，疾病控制包括预防和治疗人类感染。然而,疟疾疫苗仍处于试验阶段，甚至还没有在项目级别上使用。此外,疟疾寄生虫现在显示出抗疟疾药物的耐药性增强药物［2］．因此，疟疾病媒控制旨在防止传播疟原虫通过使用杀虫剂处理过的蚊帐和/或室内杀虫剂残留喷洒杀灭寄生虫变得至关重要。然而，许多基于喷洒的疟疾病媒控制项目被停止，因为疟疾蚊子种群对杀虫剂产生了耐药性[3.]，如A冈比亚nopheles复杂贾尔斯1902[双翅目:库蚊科]，非洲疟疾的主要媒介。迄今为止，仅推荐5种拟除虫菊酯类杀虫剂(α-氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯和氯菊酯)和1种伪拟除虫菊酯类杀虫剂(乙醚菊酯)用于净浸渍[4］．但是，很多研究报告了一些南撒哈拉非洲人群对拟除虫菊酯的耐药性冈比亚按蚊［5-7］．这种耐药性的传播构成了可能阻碍疟疾病媒控制战略的威胁。因此，由于推荐用于减少疟疾传播的合适杀虫剂数量有限[8]、氨基甲酸酯类杀虫剂和有机磷类杀虫剂被认为是控制抗药性蚊子的潜在替代化合物[9］．氨基甲酸酯和有机磷酸盐的使用令人担忧的是，对这些杀虫剂的抗药性已经存在于冈比亚按蚊来自西非的人口[10］．编码乙酰胆碱酯酶(AChE酶)的ace-1基因是常染色体的，据报道与蚊子对氨基甲酸酯和有机磷的抗性有关[11］．

对这些杀虫剂作用靶点(AChE酶)的研究表明，抗药性是由单点引起的突变在ace-1基因中，导致甘氨酸(GGC)替换为丝氨酸(AGC);叫G119S突变导致AChE1酶不敏感[12］．的G119S突变据报道发生在冈比亚按蚊至少四次[13］．

目前的调查是在Côte科特迪瓦进行的，目的是调查实地的耐药性水平冈比亚按蚊种群对氨基甲酸酯类和有机磷类杀虫剂的未来可能与拟除虫菊酯结合使用。

材料与方法

冈比亚按蚊抽样

幼虫的冈比亚按蚊分别于2012年2月至5月在8个不同地区的稻田和水坑中采集，分别是Korhogo (Natiokobadara)， Bouaké (Yaokoffikro)， Toumodi, Tiassalé， Abidjan (Adiopodoumé)， Zouan-Hounien, Tanda和Daloa Côte d ivoire (图1)．

幼虫在本地饲养至成虫阶段。实验蚊形态鉴定，仅为雌蚊冈比亚按蚊被选作生物测定。生物测定是用3 - 5天大的非血液喂养的雌性进行的。“基苏木”系冈比亚按蚊在生物测定时作为敏感参比。

以大田蚊为对照，用硅胶干燥，-20℃保存分子生物学分析即基因型鉴定。两种参考实验室菌株冈比亚按蚊用于基因型鉴定。对本研究中使用的所有杀虫剂都敏感的“Kisumu”参考品系源自肯尼亚。“Acerkis”菌株，是G119S的纯合子突变并且对氨基甲酸酯类和有机磷类杀虫剂都有抗性。

“Kisumu”和“Acerkis”都是在分开的房间里饲养的。

生物分析

利用世卫组织杀虫剂敏感性测试试剂盒对成蚊进行生物测定，使用两种氨基甲酸酯，即0.4%恶虫威和0.1%残杀威，以及两种有机磷，即1%灭亚威和0.4%毒死蜱-甲基浸渍纸[1，14］．经杀虫剂浸渍的纸张是由世卫组织合作机构马来西亚圣恩大学提供的。

用10%蜂蜜溶液保温24 h后测定蚊虫死亡率。所有实验分别在25°C和70% ~ 80% RH的温度和湿度下进行。

基因型鉴定

个体蚊子的基因组DNA提取使用简化版协议柯林斯的[15］．然后，采用PCR-RFLP分析评估ace-1基因型[13］．

数据分析

根据世界卫生组织的标准计算和分析死亡率，以确定样本是否敏感或耐药[1，14］．

利用GENEPOP软件计算ace-1位点上的抗性等位基因频率[16]，版本4.6。检验是否符合Hardy-Weinberg平衡[17]，并根据Weir和Cockerham估计了随机配对偏差的Fis指数模型［18］．

结果

“Kisumu”品系和对照组的死亡率

作为敏感参比的“Kisumu”菌株在所有杀虫剂保持24h后死亡率为100%。

在所有生物测定中作为对照的大田蚊子的死亡率都非常低。每次生物测定使用100只以上的蚊子，其值从0到4%不等。因此，整个调查的所有生物分析都是验证的，没有按照Bonferroni的顺序程序进行调整[19］．

外地死亡率冈比亚按蚊

氨基甲酸盐杀虫剂:只有邹-霍恩地区的蚊子死亡率较高(99%至0.4%)(表1)．外地死亡率冈比亚按蚊其他所有的研究地点都非常低(<90%)，表明对0.4%恶虫威有抗性的蚊子。

表1:暴露于0.4%恶虫威和0.1%残杀威1小时后24小时内野外冈比亚拟蚊的死亡率。

使用0.1%残杀威时，只有Tiassalé的蚊子显示出较高的死亡率(91%)，突出了可能的耐药性。其他死亡率都是低(< 90%)。然而，由于可利用的成蚊数量不足，没有对该杀虫剂的所有目标研究地点进行生物测定。因此，来自Bouaké (Yaokoffikro)和Toumodi的蚊子表现得非常低死亡率强调对恶虫威和残杀威有很强的抵抗力。

只有Korhogo (Natiokobadara)的田间蚊子在0.4%恶虫威和0.1%残杀威的作用下(分别为79%和78%)死亡率相同。在所有其他研究地点，这两种杀虫剂的数值是不同的。

有机磷杀虫剂:只有左-霍恩地区的蚊子死亡率较高(100%至1%)(表2)．外地死亡率冈比亚按蚊其他所有的研究地点都非常低(<90%)，表明耐药蚊子。

表2:1%灭亚磷和0.4%甲基毒死蜱接触1小时后24小时内野外冈比亚拟蚊的死亡率。

使用0.4%的甲基毒死蜱，蚊子的死亡率很高。只有来自阿比让(Adiopodoumé)的蚊子表现出明显的抗药性(87%)。

G119S的基因型分布突变现场轨迹冈比亚按蚊人口

346(346)个人冈比亚按蚊是否检测到了ace-1^R（表3)．田间个体基因型结果冈比亚按蚊在整个调查中发现的耐药纯合蚊很少(4只)，而易感纯合和杂合蚊较多。在Toumodi、Zouan-Hounien、Tanda和Daloa，易感纯合子占多数，而在Korhogo (Natiokobadara)、Bouaké (Yaokoffikro)、Tiassalé和Abidjan (Adiopodoumé)，杂合子个体占优势。

表3:G119S野地冈比亚拟虫基因型变异突变轨迹。

田间抗乙酰胆碱酯酶等位基因的频率冈比亚按蚊人口

乙酰胆碱酯酶抗性等位基因(ace-1)的频率^R)在野外冈比亚按蚊种群数量较低，在左-霍宁县为0，在Bouaké (Yaokoffikro)为0.52 (表4)．的ace-1^R大城镇Korhogo (Natiokobadara)、Bouaké (Yaokoffikro)、Tiassalé和阿比让(Adiopodoumé)的频率似乎相对高于小城镇Toumodi、Zouan-Hounien和Tanda。

表4:野外冈比亚拟冈比亚种群ace-1R频率的变化。

四(4)场冈比亚按蚊分析的8只蚊虫种群均未达到Hardy-Weinberg平衡(P (HW) <0.05)， Fis (W&C)均<0，表明在ace-1位点上存在系统性的杂合个体。在Toumodi, Zouan-Hounien和Tanda, ace-1^R频率非常高低Hardy-Weinberg平衡的精确概率最大(P (HW)=1.00)。在Daloa, P(HW)为0.57>0.05低ace-1的频率^R．

讨论

在氨基甲酸酯类杀虫剂中，只有祖-霍恩地区的蚊子对恶虫威敏感。所有其他研究地点的蚊子都对这种杀虫剂有抗药性。Tiassalé的野蚊也显示可能对残杀威有耐药性。

在有机磷环境中，对灭螨威敏感的单一样本为左-霍恩地区。相反，只有来自阿比让的地蚊对甲基毒死蜱具有抗性。

这些生物测定数据显示，现场蚊子对恶虫威、残杀威和灭硝威具有抗性，而在几乎所有研究地点，有机磷毒死蜱-甲基对疟疾病媒控制仍然绝对有效。相反，对抗纯合子实验室菌株AcerKis的调查显示，与各种有机磷(12至30倍)相比，AcerKis对各种氨基甲酸酯(3000至5000倍)的抗性水平非常高[20.］．目前的生物测定也强调了强抗性冈比亚按蚊特别是在阿比让(Adiopodoumé)和Bouaké (Yaokoffikro)。的确，对拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类和有机氯类有抗性冈比亚按蚊已在Bouaké上报道(Yaokoffikro) [21］．

个体田间基因型冈比亚按蚊在ace-1基因座(4只)发现了很少的耐药纯合蚊，而在整个研究中检测到的346只蚊子中有162只杂合蚊。据报道，ace-1位点的纯合子数非常多低在科特迪瓦数个地点[10］．本研究中Fis (W&C)的阴性值表明ace-1位点的杂合个体的系统性超过，正如记录的基因型所报告的那样，可以影响抗性水平。这加强了生物分析的结果，并可能是有关耐药机制的重要信息冈比亚按蚊在研究地点。事实上，研究表明，25%的乙酰胆碱酯酶活性足以保护黑腹果蝇免受杀虫剂的侵害[22］．因此，具有50%敏感和50%不敏感的杀虫剂目标分子的杂合子个体将像纯合子蚊子一样在遗传上做出反应，从而抵抗杀虫剂的致死作用，这表明ace-1^R是显性等位基因。

ace-1的频率^R在现场冈比亚按蚊Zouan-Hounien为0,Bouaké (Yaokoffikro)为0.52。这些结果加强了生物测定，强调了走安-霍恩地区缺乏或弱的抗氨基甲酸酯和有机磷的机制。祖安-胡尼恩市位于科特迪瓦西部Danané地区，之前的一项研究曾在那里报道过低耐药等位基因在KDR上的频率突变L1014F轨迹[7]使若干西非国家对各种拟除虫菊酯和滴滴涕产生交叉耐药性[23］．

ace-1的频率^R本研究现场为0.50，现场为0.52冈比亚按蚊分别在阿比让(Adiopodoumé)和Bouaké (Yaokoffikro)。ace-1的频率^R在2009年进行的前一次调查中，姚科菲克罗为0.32 [10]，表明阻力增加了。的确，对G119S所赋予的优势水平的调查突变在冈比亚按蚊报道称，这种耐药机制可在田间迅速传播，进而危及有机磷和氨基甲酸酯化合物在公共场合的使用健康［20.］．

然而，最近有研究指出，将甲基吡虫磷(一种有机磷酸盐)与溴氰菊酯长效杀虫网(LLIN)联合使用并没有改善冈比亚按蚊控制或个人保护与LLIN单独在实验小屋进行比较大米字段Tiassalé，强调如果对杀虫剂的多重耐药性继续蔓延，疟疾病媒控制项目将面临挑战[24］．

结论

目前的调查突出了田间阻力冈比亚按蚊在Côte科特迪瓦的几个地点，蚊子对恶虫威、残杀威和灭螨威具有相对易感性。

的低ace-1的频率^R在现场冈比亚按蚊揭示了G119S突变并不是研究地点对氨基甲酸酯类和有机磷类杀虫剂产生抗性的主要机制。

致谢

我们感谢所有志愿者和地方协调员，他们在疟疾多边行动规划下为热带病特别规划/世卫组织支持下的这项研究的成果做出了贡献。我们赞赏贝宁国际人道主义援助计划与Côte d ' ivvoire的CEMV之间的出色合作。

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