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一些特点的细菌素和冷休克蛋白株乳杆菌Ul485隔绝曹国伟的色调在越南

*通信:

Uyen琼阮、酶类蛋白质实验室研究所微生物学和生物技术、越南河内国家大学、越南、电子邮件:uyennq@vnu.edu.vn

文摘

乳酸菌(实验室)和细菌素在我们的生活中已经应用于许多领域。在实验室,乳杆菌发酵剂或益生菌等一些基本的角色。在这项研究中,细菌素合成的菌株l .杆菌UL485孤立于发酵的“潮”色调省在越南部分特征。此外,冷休克蛋白(Csp)的应变和细菌的生存温度调低速档后冻结主要是研究。特别是,pH值和温度对细菌素的影响,包含文化上层清液的应变进行了评估。细菌素的部分通过阳离子交换色谱纯化。克隆后,推导出冷休克蛋白的氨基酸被确定。此外,冻结后,细菌的生存比例随温度调低速档从30°C到8°C的日志增长阶段增加相比,细菌没有温度调低速档。

关键字

活动;细菌素;克隆;冷休克蛋白;乳酸菌(实验室)

介绍

乳酸菌(实验室)被认为是肝(通常被认为是安全的)。实验室有能力合成有用的物质如细菌素、有机酸(乳酸和乙酸等)和胞外1,2]。细菌素由核糖体途径合成,他们拥有抗菌活性以及其他有价值的属性(3]。许多plantaricins详细研究了(4]。由于其广泛的应用,不仅实验室,而且细菌素吸引许多科学家的兴趣。

乳酸菌是一个实验室的大属。其中,乳杆菌扮演着许多重要的角色,如发酵剂或益生菌。的生存和功能产生的细菌素l .杆菌两个主题在食品加工行业的极大兴趣。许多出版物显示冷休克蛋白(Csp)的功能适应过程中细菌新的环境条件下,特别是在温度调低速档(5]。Csp(年代)家庭蛋白质的分子量约kDa,分享高度相似的序列。快速温度调低速档后,冷休克蛋白调节细菌的适应压力(6]。

在这项研究中,细菌素合成的压力l .杆菌UL485从发酵的“超”色调分离省份在越南部分特征。特别是,细菌素包含文化上层清液的耐温度(在100°C,活动保持在80.5%),它在相当广泛的pH值(十)。通过阳离子交换色谱净化后,细菌素的纯度提高到4.89倍。冷休克蛋白基因编码(Csp)的应变是克隆然后被确认为中海壳牌的蛋白质。此外,生存的压力温度调低速档后30°C到8°C 2, 5, 8小时的日志增长阶段最初地评估。

材料和方法

菌株

压力l .杆菌UL485发酵豆腐隔绝的“潮”色调省(越南),它是由16 s rDNA基因测序和糖发酵通过使用API模式分析CH50(美国bioMerieux SA) [7]。应变是存储在-80°C夫人介质(Oxoid Basing-stoke,英国)和15%的甘油,在使用之前,这是夫人传播媒介在30°C为24 - 48小时。应变指标是乳酸菌sakei无性系种群。sakei JCM1157。

所有化学品都购自西格玛奥德里奇(美国);夫人和磅媒体从Oxoid购买,Basing-stoke,联合王国。

细菌素和活动单元(AU)的决心

上层清液,从应变UL485培养基,获得包含注入了盘子乳酸菌sakei无性系种群。sakeiJCM1157。细菌素是由抗菌区周围的井。细菌素的活性单位(AU)由以下公式(8]:

活动单元(AU) =

在V是样品体积(μL),和2ⁿ是最低的2倍稀释的样本细菌素的活动没有被观察到。

温度和pH值对细菌素的影响的活动

样品的pH值调整的值5,6,7,8,9和10所示。之后,样本孵化30°C三小时后,样品的细菌素的活动在每个pH值是为了检查评估博士同样的影响,温度在不同的时间间隔(100°C)(0、5、15、30、45、60分钟)是用来确定温度对细菌素的活动的影响。

细菌素纯化

细菌素是浮在表面的游离的纯化的培养基l .杆菌UL485生长对数期后期在夫人介质在30°C。6毫升的示例加载在HiTrap SP FF栏1毫升AKTA系统(通用电气医疗集团)与1毫升/分钟的流量。洗后10毫升的缓冲区(醋酸钠0.02米,pH = 5.5),然后5毫升的0.3 M氯化钠在缓冲区,5毫升的细菌素是筛选了0.5生理盐水缓冲在分数为0.5毫升。每个分数的细菌素活性检测在琼脂板包含指标压力。分数拥有抗菌活性是由布拉德福德法联合检测总蛋白(9)和非盟(8]。此外,总蛋白和非盟的上层清液,经过色谱法,测定评价的纯度和产量色谱法的过程。

电泳

阳离子交换后获得的样本色谱法受到了电泳。电泳执行后Laemmli方法15%聚丙烯酰胺凝胶除了系统不包含SDS和β-mercaptoethanol [10]。完成后,凝胶切成两部分。包含样本的一部分低分子标准(Fermentas)被考马斯亮蓝染色R250,而另一部分是固定立即20%异丙醇溶液和10%醋酸为2个小时,然后用去离子水清洗24小时。这种凝胶是放置在培养皿中包含约10⁶细胞指标的应变,然后板在30°C孵化24 - 48小时。后,抑菌圈评估(11]。

PCR和克隆

DNA基因组提取和主管细胞的大肠杆菌DH5α后进行协议Sambrook j . et al (12]。DNA基因组应变是用作csp基因的扩增的模板用引物(csp1a: 5 ' GGTTTAATGTAGACAARGGNTTYGGNTTYAT 3 '和csp1b: 5 ' TAGTAGGTACCRTTNGCNGCYTGNGGNCC 3 ')的178个基点的预期大小聚合酶链反应产品(13,14]。反应混合物(50μL)包含5μL 10 x大师混合缓冲,50 pmol每个引物2.5 U (Taq DNA聚合酶,1μL模板DNA。Thermocycles的聚合酶链反应包括5分钟的热休克在95°C,紧随其后的是30 95°C的周期为30秒,30秒55°C, 72°C 30分钟和最后一个扩展在72°C 10分钟。的聚合酶链反应产品被观察到电泳1%琼脂糖凝胶,纯化,克隆到pGEM-T向量(Promega),然后转化为主管细胞大肠杆菌DH5α。之后,样本被送到1^圣基地公司(新加坡)测序。Clustalω,ExPASy工具被用来分析csp基因的核苷酸和氨基酸序列和csp蛋白质存在的压力。

生存的评估

菌株生长在培养基夫人在30°C 2.5 - 4小时,直到OD600文化达到0.3 - -0.5。文化被分成一些样品:一个样本立即冻结在-20°C,和其他冷震惊从30°C为2 8°C,分别为5和8个小时前他们冻结在-20°C (13,15]。对于每一个样本,冷冻前后,集落形成单位(CFU)系列稀释在无菌水给可行的百分比计算细胞为每个样本。所有实验都是一式三份。四是用于统计。

结果

温度和pH值对细菌素的影响的活动

温度和pH值的影响在细菌素包含的文化浮在表面的应变UL485进行评估(图1)。

结果表明细菌素的活性,其中包含的文化上层的压力l .杆菌UL485维持在80.5%在100°C和细菌素在4到10的pH值。

净化细菌素合成的菌株l .杆菌UL485

净化和净化细菌素合成的应变结果l .杆菌UL485通过阳离子交换柱了图2和表1,分别。

表1:增溶指数(SI)的公安局隔离从咖啡树的根际分离Pikovskaya吗?琼脂板,计算的比率光环直径(毫米)/菌落直径(毫米)。

为了大致估计细菌素的分子质量,阳离子交换后获得的样本色谱法受到了电泳(图3)。

的结果电泳表明,细菌素的分子量色谱后获得
是略高于10 kDa。

冷休克蛋白后的应变UL485和生存温度调低速档

净化后,具体聚合酶链反应产品放大csp菌株的基因l .杆菌UL485克隆成pGEM-T向量(Promega)及其核苷酸序列得到结果(这里没有显示)。这些核苷酸的推导氨基酸序列表明Csp蛋白质包含2守恒的RNA结合主题(RNP-1和RNP-2)。此外,RNA结合主题(RNP-1和RNP-2)应变的Csp的蛋白质l .杆菌UL485和应变l .杆菌NC8是相同的。Csp的推导出氨基酸蛋白质应变UL485和中海壳牌的压力l .杆菌NC8相似,相同的91.23%和94.74%分别(图4)。

为了测试Csp蛋白质存在于应变的函数l .杆菌UL485,生存的压力温度调低速档后(30°C到8°C)为2、5和8小时的日志增长阶段最初地评估(图5)。

结果表明,生存的压力立即冻结在-20°C大幅下降,但它逐渐增加的样品随温度调低速档(30°C到8°C)的日志增长阶段2,5,8小时。特别是,样品的生存比例随温度调低速档8个小时35.41%到13.21%的样本没有温度调低速档。

讨论和结论

乳杆菌被广泛用作发酵食品开始在许多变量。因此它能够产生有用的物质如细菌素,乳酸,胞外以及生存能力在不同条件下的重大利益。在我们的研究中,压力l .杆菌UL485显示合成细菌素的能力,拥有冷休克蛋白中海壳牌的基因编码。

细菌素包含的文化浮在表面的应变UL485稳定温度(在100°C,活动保持在80.5%),这在相当广泛的pH值(pH值10,活动保持在64.4%)。净化细菌素的菌株进行UL485这里只是一个步骤,因此部分纯化细菌素的纯度和产量都不高。此外,众所周知,l .杆菌,plantaricin PlnEF是two-peptide细菌素的分子量分别为3.7和3.5 kDa。此外,plantaricin PlnA是一个肽的分子量信息素5.4 kDa [4]。UL485被确认为l .杆菌基于16 s rDNA基因测序的结果和糖发酵模式分析。PlnEF和PlnA被检测到的基因编码这一毒株(7]。

此外,没有聚合酶链反应产品使用特定的引物时观察到的其他plantaricins放大过程(数据没有显示)。我们的结果电泳与已知的信息是一致的压力呢l .杆菌UL485。

此外,Csp中存在应变被确认为中海壳牌的氨基酸分别为91.23%和94.74%相同和类似的中海壳牌l .杆菌NC8 [6]。众所周知,Csp蛋白质在冷适应的细菌细胞发挥作用,但具体行动和Csp (s)相互作用的机制,通过履行其功能尚未阐明。中海壳牌大幅下降的mRNA平稳增长阶段l .杆菌(16),因此这种蛋白质的作用是测试应变的温度时幅度已经从30°C到8°C 2, 5, 8小时的日志增长阶段。冻结后我们的结果表明,细菌生存的增加;然而,存活率无显著差异观察细菌之间,没有温度调低速档从30°C到8°C。

这里的信息报道的冷休克蛋白对细菌素和压力l .杆菌UL485可能是有用的应用程序的压力在我们的日常生活。

承认

这项研究支持”典型的评价乳酸菌适用于食品、制药和动物饲料”科技部授予。

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