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RNase 9蛋白抑制精子获能和顶体反应

*通信:

刘杰烟台市玉皇顶医院生物芯片实验室电话:+86 535 669 1999;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

核糖核酸酶9是核糖核酸酶a超家族的一员。它只表现在附睾。然而，它缺乏核糖解核活性，其功能尚不清楚。免疫荧光实验表明，在获能和顶体反应过程中，RNase9蛋白在精子表面的位置发生了变化，蛋白从颈部迁移到顶体帽部。通过CTC染色评价RNase9在获能和顶体反应中的作用。与对照组(含3%BSA的PBS)相比，由PBS诱导的自发顶体反应孕酮RNase 9蛋白可抑制，AR率为6.5±1.2%。精子暴露于RNase9蛋白也使顶体反应期间细胞内cAMP水平显著降低(111±24.5 vs 187±18 fmol/106精子;P < 0.05)。这些实验证实了RNase 9蛋白显著损害精子功能，包括获能和顶体反应，并为其在男性生殖毒性方面的潜力提供了证据。

关键字

核糖核酸酶9;精子获能;顶体反应

简介

人RNase 9蛋白属于RNase A家庭成员(1-3.］．RNase 9蛋白主要在内皮细胞中表达细胞附睾的，位于精子的后赤道区域。先前的研究表明，重组人RNase 9对酵母tRNA不表现出可检测的核糖核酸溶解活性，但对酵母tRNA表现出抗菌活性，并以浓度/时间依赖的方式大肠杆菌［4］．该蛋白在精子成熟、活力和受精方面的研究尚未见报道。

精子获能是所有哺乳动物精子受精前必须经历的一个生理阶段[5］．精子获能研究的一个主要难点是精子获能过程中形态变化的缺失。

生物化学变化包括精子表面附睾蛋白和精浆蛋白的去除或重新分布、膜脂组成的改变、膜蛋白迁移和受体暴露[6-8］．最近，Yanagim achi [9]提出了一个工作假设:他认为在精子获能过程中，精子表面蛋白的变化包括受体的丢失或激活、位置的变化等刺激了G2蛋白，激活了Ca^２＋通道和钙离子的流入是激活超激活的关键。依赖蛋白激酶途径和酪氨酸激酶途径是精子获能过程的主要途径[10-12］．RNase 9蛋白定位于精子表面，是否与精子获能、顶体反应和受精有关有待进一步研究。

材料与方法

精液样本的来源和处理

根据世界健康根据组织(世卫组织，1999年)推荐的程序，通过自慰从健康的正常精子捐赠者那里收集精液样本。所有人都是在知情同意的情况下被招募的。在加工前，所有样品都被制作到一次性容器中，并放置至少30分钟以液化。精子在BWW培养基中洗涤三次(700 g, 7 min)。重悬精子的密度为1.0*106/ml。分别在赋能0、3、5 h时进行涂片。精子获能后,孕酮加入精子中，37℃孵育30分钟。

化学品及仪器

本实验室构建了重组人RNase 9抗体。BWW获能培养基、黄体酮、金四环素、碘化丙啶(PI)均来自Sigma公司。山羊抗小鼠IgG标记FITC购自北京泽泽金桥生物科技有限公司。孕酮是新鲜准备的股票使用前请在二甲基亚砜(DMSO)溶液中使用。将1.5 mg金四环素溶于10 ml冷TN溶液中，NaOH调节至PH 7.8。荧光显微镜和共聚焦显微镜购自德国徕卡。

精子的准备

精液在37℃液化，用45% ~ 90% Percoll分离，600 g离心18 min。精子洗涤3次后，用Bww液重悬。调整精子浓度至1*106/ML, 37℃5% CO孵育₂孵化器。

精子免疫荧光

精液样本的处理和以前一样。精子在37°C 5% CO的BWW中孵育0 h、3 h、5 h₂培养箱诱导顶体反应。取10 μl精子悬液涂抹，甲醇固定10 min。滴入抗RNase 9的小鼠多克隆抗体(1:400稀释)，涂片在4°C孵育过夜。用PI染色精核，激光共聚焦扫描显微镜观察。阴性对照组在含3% BSA的PBS中孵育(图1)．

精子获能和AR的评价

向上游动的精子悬浮液被分为三个等分，其中含有至少10*106个精子。这些精子分别与RNase 9 (0.8 ug/ml)、抗RNase 9和PBS (3%BSA)在BWW培养基中共培养。孵育5 h后，按照上述步骤进行CTC染色，CTC荧光染色可分为三种类型(F、B、AR): F型为未获能精子，顶体帽完整，黄绿色荧光强烈;B型为获能精子。顶体帽完整，仅在顶体帽后部有荧光带;AR图显示顶体区呈浅绿色或无荧光。每次涂片至少有200个精子。重复进行三个独立的实验，计算F, B和AR模式的百分比(图2)．

循环AMP测量

向上游动的精子悬浮液被分为三个等分，其中含有至少10 *106个精子。这些精子分别与RNase 9 (0.8 ug/ml)、抗RNase 9和PBS (3%BSA)在BWW培养基中共培养。孵育5 h后，分离精子，用0.1 M HCl均质。匀浆在10000 g室温下离心30分钟，上清液乙酰化，然后根据商业试剂盒制造商(Cyclic AMP Complete ELISA kit, Abcam)的说明测定cAMP浓度。计算每106个精子中cAMP母粒的cAMP水平。

该图表示重复进行的三个独立实验的平均值+扫描电镜。PBS (3%BSA):对照组。* p < 0.05。

结果

RNase9在获能和AR过程中的定位变化

RNase 9蛋白位于正常精子的头颈部。在获能过程中，RNase 9蛋白在精子上由头颈部向赤道区域迁移。获能3h后，精子头颈部的绿色荧光染色逐渐减弱。使能5小时后，在赤道区域有明显可见的绿色荧光带。RNase9蛋白进一步从赤道区迁移到顶体，覆盖整个顶体帽孕酮诱导顶体反应时，精子顶体颜色较浅，可释放顶蛋白。赤道区仅有少量绿色荧光。

RNase 9对赋能和AR的影响

免疫荧光实验发现，在获能和顶体反应过程中，RNase9蛋白的定位在精子表面重新分布。RNase 9蛋白是否参与获能和顶体反应有待进一步研究。自发性AR发生率明显降低(6.5±1.2%;精子与RNase9蛋白(0.8 ng/ml)在BWW共培养时，F型率为78±5.6% (P<0.05)。图2)．与PBS (3%BSA)组相比，抗rnase9不影响精子获能和顶体反应。

细胞内cAMP水平

精子在女性生殖道中的获能是获得精子与卵子受精能力的关键前提。cAMP在导致哺乳动物获能(De Jonge)和AR (Doherty et al.，)的分子事件中也起着关键作用。这促使我们在RNase9存在的情况下测量精子获能或顶体反应中的cAMP，以分析该蛋白的潜在作用。在三个独立的重复实验中，精子暴露于RNase9蛋白(0.8 ng/ml)时，顶体反应期间细胞内cAMP水平显著降低(111±24.5 vs 187±18 fmol/106精子;P < 0.05,图3)．与对照样品相比，抗rnase9处理精子仅使细胞内cAMP水平发生轻微或无显著变化(179.6±13.4和187±18 fmol/106个精子(p> 0.05) (图3)．

讨论与结论

在人类中发现了13个RNase A超家族成员。RNase9-13是新发现的男性生殖器官成员[13-15］．RNase9和RNasel0在小鼠和猪附睾中的特异性表达已有报道，但其功能尚不清楚[16］．哺乳动物精子在雌性生殖道中只有经过生理和形态上的变化才能获得受精能力。精子获能是一个多步骤的过程，是顶体反应、超活化运动和受精的重要生理前提[17］．获能作用包括精子膜蛋白的改变和膜流动性的改变，直到顶体反应发生。精子获能的分子机制相当复杂，尚未完全阐明。研究发现，精子在获能过程中，RNase9在精子表面的亚细胞定位发生变化或重新分布，提示RNase9蛋白可能参与了获能过程。CTC染色结果还发现RNase9蛋白抑制精子获能和顶体反应。与CTC染色结果一致，RNase 9蛋白的存在抑制了精子获能中cAMP的水平。这些实验证实了RNase 9蛋白显著损害精子功能，包括获能和顶体反应，并为其在男性生殖毒性方面的潜力提供了证据。

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