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生产、优化和局部净化酸性蛋白酶的曲霉菌。孤立从土壤污染的屠宰场浪费

*通信:

g .哈、应用微生物学Sri Venkateswara大学病毒学实验室部门Tirupati,美联社,印度、电子邮件:(电子邮件保护)

文摘

酸蛋白酶应用于制药、食品、皮革、洗涤剂等行业。在这项研究中,我们进行了优化蛋白酶生产一次通过一个变量。淹没发酵的真菌文化曲霉属真菌发起了相同量的糖蜜和奶酪乳清。孵化的最佳pH值和时间进行/ pH值范围2 - 9和时间3 - 7天。进一步酶效率测试有1% (w / v)其次是碳源氮来源。最好的碳和氮源优化高达3% (w / v)。原油蛋白酶被执行部分纯化盐沉淀在40 - 85%饱和度。的蛋白酶活动获得了3.648μ/毫升的最佳pH值4.5和5天的孵化。最好附加氮源被发现大豆食物及其最佳浓度是1% (w / v)决定的。同样增强葡萄糖酶活性从4.171到4.638 U /毫升,最后发现最优值为1.5% (w / v)。生产介质的酸蛋白酶从曲霉菌种虫害的目的是通过传统的方法,一次一个变量(OVAT)以一种简单的方式。酶活性峰值被发现4.638 U /毫升与糖蜜和奶酪乳清补充1% (w / v)大豆膳食和1.5% (w / v)的葡萄糖。的蛋白酶部分纯化通过硫酸铵沉淀,紧随其后的是吗透析与一个增强的活动5.545μ/毫升。

关键字

酸性蛋白酶、曲霉菌,优化部分纯化

介绍

蛋白酶是重要的工业酶由于其巨大的应用在制药、食品、皮革、洗涤剂等生物技术行业和这些占酶总销量的60%1,2]。这些生物催化剂分为酸性、中性和碱性蛋白酶的pH值基于他们现在最大的活动3]。酸蛋白酶从真菌物种利用了更多的工业应用4]。

淹没发酵(SmF)最好是用于生产蛋白酶(5]。在这个过程中微生物细胞和媒体组件存在于淹没状态在液体培养基中大量的水溶液(6]。自内容处于淹没状态更为高效,质量和热量的传递,是顺从的建模过程。扩大的过程非常简单。下游加工的酶是通过各种单元操作如离心、过滤、沉淀、溶剂萃取、膜分离过程,色谱法,超临界流体萃取(7]。

糖蜜,制糖工业的副产品,是一种attractiv7e发酵媒介以来主要成分是营养和矿物质,促进微生物的生长。此外,这是一个低成本的原始物质以及大量可用的(5]。同样的奶酪乳清废水的乳制品行业是一个很好的蛋白质来源,可以取代商业可用的氮源。考虑,对蛋白酶的不断增长的需求和需要商业经济蛋白酶有用酸性蛋白酶从小说的来源,本研究是优化生产酸的文化条件蛋白酶通过SmF曲霉菌种虫害孤立使用OVAT从屠宰场废物污染的土壤和净化酸蛋白酶通过硫酸铵沉淀的方法。

材料和方法

材料

所有使用的化学物质调查均为分析纯。糖蜜和奶酪乳清从当地采购糖和奶制品行业。

真菌文化

的真菌文化,曲霉属真菌种虫害用于本研究分离土壤污染的屠宰场浪费受污染的土壤(5]。

淹没发酵(SmF)

当地采购糖蜜高度粘性布朗有色溶液稀释10倍的友好的生产。这是消毒在121°C, 15 psi 20分钟。蛋白质的来源,奶酪乳清,被暴露在紫外线辐射消毒30分钟,以避免变性蛋白质含量在灭菌的乳清。发酵在250毫升进行锥形烧瓶与1:1的比例消毒糖蜜和奶酪乳清,然后接种5% (v / v)分生孢子的暂停曲霉属真菌spp。进一步瓶被转移到瓶,七天孵化150 rpm, 320 c。之后,瓶的内容通过绘画纸第一滤纸过滤,滤液用于试验蛋白酶(8]。的活动蛋白酶表示为μ/毫升的酶。一个单位的蛋白酶被定义为释放μmole之一的酪氨酸酶量在试验条件下/分钟。蛋白质分析了洛瑞的方法(9]。

pH值的影响

初始pH值的影响发酵媒介对经济增长的曲霉属真菌种虫害和酶生产率进行了研究与pH值范围2 - 9所示。

孵化时间

孵化的时间是由执行决定发酵对3、4、5、6和7天介质组成的平等的糖蜜和奶酪乳清的温度32°C。

氮源的影响蛋白酶生产

氮源对酸的影响蛋白酶研究了生产使用中包含25毫升的糖蜜,25毫升的奶酪乳清和补充了1% (w / v)的不同氮源如硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、酪蛋白、牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物和大豆。实验进一步进行不同浓度的大豆食物从0。5 - 6% (w / v)。

碳源对酶的活性的作用。

碳源的影响蛋白酶生产进行了研究使用媒体含有葡萄糖(1%)、甘露醇、蔗糖、乳糖、纤维素和淀粉。这项研究是进行不同浓度的葡萄糖来确定最优浓度的葡萄糖在SmF 0.5 - 3%的范围。

偏酸性蛋白酶的纯化

粗酶的纯化发酵汤,第一次滤液离心机在4000 rpm 45分钟在40度的蛋白质混合物被盐沉淀从上层清液中恢复。慢慢地,硫酸铵添加25毫升的粗酶源不断的搅拌。盐的浓度从40增加5%增加到85%饱和为了沉淀蛋白质。结果被离心分离沉淀在3000 rpm为30分钟40°C。固体颗粒溶解在50 mM Tris-HCl (pH值5.5)。导致蛋白质混合物是脱盐透析24小时使用硝化纤维膜和MWCO < 10 KDA。样本分析蛋白酶净化的每一步。

结果和讨论

细胞外酸蛋白酶是当地土壤隔离在SmF生产曲霉属真菌种虫害糖蜜为主要碳补充而奶酪乳清是作为主要的氮源。

pH值对酶活性的影响

pH值的影响蛋白酶生产中所示图1一个。从这个情节,注意到初始发酵培养基的生产起到了至关重要的作用目前对酶催化活性和生物催化剂在pH值为4.5提高到最大,然后不断的增加初始pH值下降发酵媒介。因此最佳pH值在4.5作为被发现曲霉属真菌种虫害分泌活动的最大酶3.648 U /毫升。这是确认孤立真菌文化能够产生酸性蛋白酶。蛋白酶活动1.516 U得到/毫升/ pH值高于中性值。根据以前的研究(10)理化性能天门冬氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶的一种从Onopordum ecanthium,和报道,在pH值表现出它的最大活动4。

培养时间的影响

生产的时间进程蛋白酶研究了在摇动烧瓶(图1 b)在操作范围的3 - 7天的孵化介质在32°C。酶产量逐渐增加,种植时间和最高的进展蛋白酶活动是观察到第五天的孵化。之后,这种酶产量下降可能是由于不可用的营养真菌文化。类似的研究进行酸蛋白酶从曲霉菌foetidus控制发酵(11]。

氮源的影响

不同氮源对酸的影响的结果蛋白酶生产由曲霉菌种虫害中描述图2。

所有上述附加氮源主要氮源,奶酪乳清,已经成功地提高了酸蛋白酶量。生产与无机与有机氮源比来源。的蛋白酶活动对上述氮来源的范围是3.648到4.316 U /毫升。峰观察酶生产有机酪蛋白而最低的活动与硝酸铵。大豆膳食被认为是有效的附加氮源以节约发酵媒介作为其蛋白酶活动减少了8%的酪蛋白。此外,不同浓度的大豆膳食对酸的影响蛋白酶生产由曲霉菌种虫害在SmF中所示图3。从上面的结果发现1% (w / v)大豆膳食显示最大值蛋白酶活动4.171 U /毫升。类似的研究进行了碱性蛋白酶从枯草芽孢杆菌生产的设计生产中,对偶氮源,酪蛋白胨和注意增强酶活性与额外的氮源,蛋白胨(12]。

额外的碳源

酸的生产蛋白酶以糖蜜为1% (w / v)的控制和补充额外的mono - di -多糖中显示图4。与葡萄糖酶活性峰值是注意到4.438 U /毫升。轻微的增加活动被发现与甘露醇或纤维素而测试二糖,蔗糖和乳糖没有显著的额外的碳源。进一步优化的葡萄糖在操作范围内高达3% (w / v)调查和增强酶的生产力达到了1.5% (4.638 U /毫升图5)。酶活性的变化与葡萄糖浓度显然是钟形曲线所示。有一个连续生产1.5%进一步增加从4.638下降到3.812 U /毫升的3.0%到1.6 (w / v)。

类似的观察发现了酸蛋白酶生产从真菌文化(8]。此外,生产媒体多碳底物源,啤酒厂浪费,效率增加同时生产淀粉酶和蛋白酶从芽孢杆菌字幕13]。

部分纯化蛋白酶

这种酶收获用绘画纸第一过滤,滤液收集。在净化的下一个阶段,从澄清液体酶是通过另一个固液分离过程中,离心分离。稀释原油集中了酶解盐沉淀。可溶性蛋白质混合物在上层清液转化为沉淀形成的硫酸铵85% (w / v)饱和。

获得的沉淀溶解在0.05 M Tris-HCl缓冲区。膜分离过程透析采用硫酸铵盐的去除。蛋白质在滞留物被膜保留,而盐是出现在渗透。半净化酸性蛋白酶从不同的微生物在早期的研究(7,14]。

结论

在这项研究中,酸的生产中蛋白酶从曲霉菌种虫害的目的是通过OVAT方法低基质成本。真菌文化是能够把糖和乳制品工业废水的胞外酸性蛋白酶。酶活性增强从3.648到4.638 U /毫升与相同体积的糖蜜和奶酪乳清,1% (w / v)大豆膳食和1.5% (w / v)的葡萄糖的最佳pH值4.5和5天的孵化。蛋白酶部分纯化通过硫酸铵沉淀,紧随其后的是吗透析增强活动为5.545μ/毫升。

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