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研究

,卷:14(6)

植物乳杆菌Ul497冷休克蛋白存在及StrainÃⅱÂ ' Â低温下休克后存活的初步评价

*通信:
阮玉琼河北农业科学研究院酶蛋白研究室微生物学和生物技术,越南国立大学,越南河内,电子邮件: (电子邮件保护)

收到:2018年10月3日;接受:2018年10月30日;发表:2018年11月05日

引用:阮武强,武ltt。植物乳杆菌Ul497和植物乳杆菌Ul497冷休克蛋白的初步鉴定it’降温冲击后的生存。生物技术学报,2018;14(6):177。

摘要

乳酸菌(LAB)已被FDA批准为GRAS(公认安全)。乳酸菌中以植物乳杆菌为主物种乳酸菌属中的乳酸菌在许多领域,特别是在食品工业中发挥了作用。本研究将植物乳杆菌UL497冷休克蛋白(Csp)的推导氨基酸与已报道的植物乳杆菌NC8的CspL、CspC和CspP进行了比较。然后,冷冻后,在生长对数阶段,测定温度从30°C降至8°C时细菌的存活时间2,5,8小时。特别是冷冻后,生长对数期温度从30°C降至8°C的细菌的存活率比没有温度降的细菌要高。并以这些存活率为基础,初步评价冷休克持续时间对细菌存活的影响。

关键字

氨基酸;冷休克蛋白;乳酸菌(实验室);乳杆菌

简介

乳酸菌(LAB)已被FDA批准为GRAS(公认安全)。LAB能够产生多种生物活性化合物,包括细菌素、有机酸(如乳酸和乙酸)、胞外多糖和其他有价值的物质,这些物质不仅在生物体内发挥着重要作用,而且在我们生活的许多领域都发挥着重要作用医学而食品工业[1-3.].在后者中,乳杆菌存在于不同种类的发酵食品中发挥发酵剂或天然来源的防腐剂的作用。因此,l .杆菌一直是许多研究的对象。

Csp (s)家庭冷休克蛋白存在于大多数生物体中,包括不同的物种与食物有关的乳酸这些蛋白质的分子量在7 kDa左右,氨基酸序列具有高度的相似性。这些蛋白质的功能已经在许多研究中得到了研究,其中之一是这些蛋白质在细菌适应新环境条件的过程中,特别是在温度下降的过程中[45].为乳杆菌报道了三种csp蛋白,包括cspC, cspL和cspP。cspC蛋白与cspL和cspP的同源性分别为73%和74%,而cspL和cspP的同源性为88% [6].

在本研究中,根据核苷酸序列推断出Csp蛋白的氨基酸存在于菌株中乳杆菌得到UL497。这些序列与报道的CspC、CspL和CspP序列一致l .杆菌NC8。然后,在冷冻后,测定生长对数阶段温度从30°C降至8°C 2、5和8小时的细菌存活率。基于这些存活率的数值,初步评价了冷休克持续时间对细菌存活的影响。

材料与方法

菌株

菌株UL497是从越南顺化省发酵豆腐“Chao”中分离得到的。基于16S rDNA基因测序和糖发酵模式分析采用API CH50 (bioMérieux SA, USA),鉴定为l .杆菌.菌株在-80℃的MRS培养基(Oxoid, Basing-stoke, United Kingdom)中加15%甘油保存,使用前在30℃的MRS培养基中增殖24-48小时。本研究使用的指示菌株为乳酸菌sakei无性系种群。sakei JCM1157。

所有化学品和介质,包括MRS和LB介质均购自Promega(美国)、Sigma Aldrich(美国)和LAB(美国Neogen公司)。

PCR和克隆

DNA基因组提取和胜任细胞大肠杆菌DH5α在协议Sambrook J.等人[7]。DNA基因组引物(Csp1a: 5 ' GGTTTAATGTAGACAARGGNTTYGGNTTYAT 3 '和Csp1b: 5 ' TAGTAGGTACCRTTNGCNGCYTGNGGNCC 3 ')以菌株为模板扩增Csp基因,引物预期大小为178 bp聚合酶链反应产品(89].反应混合物(50 μL)中含有10X主混合缓冲液5 μL,引物各50 pmol, Taq DNA聚合酶2.5 U,模板DNA 1 μL。Thermocycles的聚合酶链反应包括95°C下5分钟的热休克,然后依次为95°C 30秒,55°C 30秒,72°C 30分钟,最后在72°C下延长10分钟。的聚合酶链反应产品由电泳纯化后,克隆到pGEM-T载体(Promega)中,然后转化为活性蛋白细胞大肠杆菌DH5α。之后将样品送到1测序基地公司(新加坡)。利用Clustal Omega、ExPASy工具对菌株中存在的Csp基因和Csp蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析。

生存的评估

菌株在MRS培养基中30°C培养2.5-4小时,直到培养物的OD600达到0.3-0.5。将培养物分为几个样品:一个样品在-20℃下立即冷冻,另一个样品在-20℃冷冻前分别从30℃到8℃冷冲击2、5和8小时[68-10].对于每个样品,在-20°C冷冻24小时之前和之后,通过在无菌水中连续稀释得到的菌落形成单位(CFU)计数,以给出存活的百分比细胞对于每个样本。所有实验都是一式三份。统计学采用t检验。

结果与讨论

菌株中存在冷休克蛋白l .杆菌UL497

聚合酶链反应该菌株CSP基因扩增产物l .杆菌检查UL47,清洗,然后按照制造商的说明克隆到pGEM-T载体(Promega)。在得到核苷酸序列后(此处未显示结果),推导出的Csp蛋白的氨基酸存在于菌株中l .杆菌UL497与菌株中已报道的CspC、CspL和CspP基因序列一致l .杆菌NC8 (图1).

biotechnology-protein

图1:对该菌株Csp蛋白的推导氨基酸进行了比对l .杆菌UL497和该菌株CspC、CspL和CspP的氨基酸l .杆菌NC8。

从测序得到的核苷酸序列推断出该菌株的Csp蛋白l .杆菌UL497含有2个保守的RNA结合基序(RNP-1和RNP-2)。推导出的菌株UL497 Csp蛋白的氨基酸百分比与已报道的Csp蛋白相同和相似,包括CspC、CspL和CspPl .杆菌NC8,在表1

Csp的蛋白质 UL497菌株Csp蛋白的推导氨基酸与其他菌株相同的百分比 UL497菌株Csp蛋白的推导氨基酸与其他菌株相似的百分比
CspL 77.19% 85.96%
CspP 70.18% 84.21%
中海壳牌 70.18% 80.70%

表1:推导出的菌株UL497的Csp蛋白氨基酸百分比与菌株L. plantarum NC8的CspC、CspL和CspP的氨基酸百分比相同且相似。

结果表明,在已报道的3种Csp蛋白中l .杆菌菌株中存在NC8、Csp蛋白l .杆菌UL497最接近CspL。UL497菌株Csp蛋白中与CspC蛋白相同和相似的氨基酸比例最低l .杆菌NC8分别为70.18%和80.70%。

温度降档后细菌的存活情况

通过对菌株中存在的Csp蛋白的氨基酸分析l .杆菌UL497,首先评估细菌在其生长对数期降温(从30°C到8°C) 5小时后的存活情况(图2).

biotechnology-bacteria

图2:温度降低和不降低时细菌的存活情况。

结果表明,在-20℃下立即冷冻的细菌存活率急剧下降(保持在8.63%),但在生长对数期冷休克(30℃至8℃)5小时后,细菌存活率上升(达到25.61%)。

冷休克持续时间对细菌存活的影响

为了评估冷休克持续时间是否会影响细菌的存活率,将培养物冷休克2、5和8小时,然后在-20℃冷冻后测定其存活率。结果用图表表示出来图3

biotechnology-survival

图3:不同降温时间下的细菌存活率。

冷冻后,所有经过2、5、8小时冷休克处理的细菌样品的存活率均高于未经过冷休克处理的细菌。值得注意的是,冷休克2、5和8小时的细菌存活率分别是非冷休克细菌的2.7、2.9和6.5倍。此外,冷休克8小时后细菌存活率与非冷休克组差异有统计学意义,经t检验p值为0.002。

讨论

乳杆菌广泛应用于多种发酵食品中,起发酵剂或防腐剂的作用。在食品工业中,细菌暴露在加工和储存条件下,包括温度下降。因此,在该领域,细菌在不同条件下的生存能力一直是一个重要的问题。在我们的研究中,在应变中l .杆菌UL497, Csp蛋白,被认为在细菌适应寒冷中起重要作用压力并初步评估冷冻后在生长对数期温度从30℃降至8℃2、5、8 h的细菌存活情况。

对菌株UL497中Csp蛋白的氨基酸分析表明,该蛋白具有Csp蛋白家族蛋白的典型特征。特别是,它含有2个保守的RNA结合基序(RNP-1和RNP-2),蛋白质通过它们在适应过程中实现其功能[45].此外,本文还分析了该蛋白的氨基酸与其他三种Csp蛋白氨基酸的同源性和相似性l .杆菌NC8含量高。其中,各菌株Csp蛋白氨基酸的同源性和相似性最高l .杆菌UL497和CspL值分别为77.19%和85.96%,[6].

许多出版物表明了Csp蛋白的作用,特别是在细菌细胞的冷适应方面。然而,具体的行动和机制,通过Csp(s)相互作用,以实现其功能在正常和压力生长条件,包括冷冲击,还不清楚。3个csp基因的mRNA表达均在植物的静止生长期下降l .杆菌10],因此Csp蛋白的作用存在于菌株中l .杆菌对UL497菌株在生长对数阶段的温度从30°C下降到8°C 2、5和8小时进行测试。我们的结果表明,冷冻后,在所有时间测试中,温度下降的细菌的存活率增加了。有趣的是,只有冷休克8小时的细菌存活率与未冷休克的细菌存活率有显著差异(p<0.05),其余样品的细菌存活率均无显著差异。人们已经知道了cspL在8°C下3小时后,mRNA增加了3-8倍,这些水平中海壳牌而且cspP基因在温度下降后保持不变[6].

我们的结果表明,该菌株的Csp蛋白l .杆菌UL497与CspL在氨基酸序列上具有最高的同源性(77.19%)和相似度(85.96%)l .杆菌NC8。在我们之前的研究中,Cspl .杆菌UL485与CspC的氨基酸序列同源性和相似性分别为91.23%和94.74%l .杆菌NC8。此外,在相同的实验条件下(在生长对数阶段,从30°C到8°C进行2、5和8小时的冷冲击),在温度降低和不降低的情况下,细菌的存活率没有显著差异[11].因此,在不同持续时间内,温度降低和不降低细菌的生存差异的原因仍然是一个需要进一步研究的问题,以提高其生存l .杆菌

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

鸣谢

本研究得到了“典型评价”的支持乳酸菌适用于食品、药品和动物饲料”。

参考文献

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目录

谷歌学者引证报告
引文:875篇

生物技术:根据谷歌学者报告,一份印度期刊收到875次引用

编入索引中

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