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质粒高吞吐量的系统的建设为发展新的抗艾滋病药物的选择源自印度尼西亚生物资源

*通信:

Azzania Fibriani生命科学与技术学院的,万隆理工学院,印度尼西亚,电话:+ 62-22-2511575;传真:+ 62-22-253 41078;电子邮件: (电子邮件保护)

文摘

艾滋病(获得性免疫缺陷病毒)引起的一种疾病艾滋病毒病毒(人类免疫缺陷攻击人体系统的病毒)。世界上99%的艾滋病的原因引起的hiv - 1。最有效的抗逆转录病毒疗法方法是目前高效抗逆转录病毒疗法(高活性抗逆转录病毒疗法)。一个在HAART治疗的组件hiv - 1蛋白酶比其他抑制剂,具有较高的遗传障碍艾滋病毒治疗方法。开发了各种研究发现一种新型抗艾滋病药物的大多数患者可以达到low-limited设置,如印度尼西亚。因此在本研究中我们构建了一个质粒可用于开发高通量系统作为新的抗艾滋病药物的选择候选人从印尼资源。质粒骨架,我们使用P00201704939构建质粒,包含AraC调节基因和GFP报告基因。的艾滋病毒Id蛋白酶二聚体域是在质粒构建骨干和转化为宿主细胞大肠杆菌BL21 (DE3)使用热休克方法。随后,转换结果证实了通过使用聚合酶链反应和Sanger测序方法。的聚合酶链反应和测序结果显示艾滋病毒Id为基因已成功转化为质粒,没有支柱突变核苷酸和氨基酸序列。

关键字

高温超导,构造,蛋白酶hiv - 1

介绍

艾滋病(获得性免疫缺陷病毒)引起的一种疾病艾滋病毒病毒(人类免疫缺陷病毒攻击免疫系统。艾滋病毒是一种逆转录病毒与9749个核苷酸组成的两个单股RNA基因组相同。艾滋病毒即分为两种主要类型hiv - 1和hiv - 2。这两种类型的基因艾滋病毒是相似的。然而,hiv - 2低毒性比hiv - 1的水平。世界上99%的艾滋病的原因是由于hiv - 1。此外,hiv - 2只出现在西非。艾滋病在美国在1981年首次被发现,到2003年有超过7000万人感染病毒中2500万人死亡(1]。

到目前为止,治疗方法已经开发使用抗艾滋病病毒的结合药物压制的传播艾滋病毒病毒。目前最有效的治疗方法是艺术(高活性抗逆转录病毒疗法)。这种疗法相结合药物包含艾滋病毒蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂(2]。

艺术治疗导致艾滋病艾滋病死亡人数大幅下降,逐渐成为慢性疾病控制。然而,抗逆转录病毒药物给艾滋病患者不能删除病毒从病人的身体。因此,药品监督管理局艾滋病毒患者应该做的生活。这长时间的治疗可能增加的可能性不服用抗艾滋病药物,导致拒绝抗艾滋病药物。然而,在抗逆转录病毒治疗,有一个hiv - 1蛋白酶抑制剂是最重要的一个阻力最低的组件蛋白酶抑制剂(2]。蛋白酶是一种酶,这种酶在病毒复制的阶段起着重要的作用。这种酶分解病毒多蛋白前体蛋白质成为功能性和病毒能够模仿本身。在自然条件下,二聚作用的两个hiv - 1蛋白酶单体蛋白水解是一个重要的过程蛋白酶活动。的形成hiv - 1蛋白酶二聚作用发生在两个阶段。首先,两个hiv - 1蛋白酶单体分子间的相互作用在互相积极的一面。其次,从两端各分子间的相互作用hiv - 1蛋白酶单体(3]。这说明二聚作用形成两个阶段的重要性hiv - 1蛋白酶单体化合物抑制二聚作用的形成的两个hiv - 1蛋白酶单体可以很好的候选人hiv - 1药物,抑制艾滋病毒复制(图1)。

Gervaix et al。4),开发了监测的方法艾滋病毒感染通过克隆质粒编码绿色荧光蛋白(GFP) t细胞稳定线(CEM)驱动的hiv - 1长末端重复。在那项研究中,CEM-GFP可以用于监控艾滋病毒传染性和抗逆转录病毒滴度药敏syncytium-inducing菌株的GFP细胞无毒。各种研究开发寻找新的抗艾滋病药物,但是迄今为止这些药物仍无法达到印尼人一般。另一方面,印尼是一个自然资源丰富的国家,其有望成为抗艾滋病病毒药物还没有被广泛的研究。因此在本研究中我们打算建立一个质粒,可用于开发一个高吞吐量的系统作为新的抗艾滋病药物的选择候选人来自印尼的生物资源利用GFP标记的表达hiv - 1蛋白酶(图2)。

质粒构建

质粒结构是指一个专利P00201704939的比喻基因专利数量protease-coding基因取代了艾滋病毒(HIV Id)。的艾滋病毒Id序列用于这项研究的合成基因密码子使用软件出现在GenScript网站优化。的顺序艾滋病毒身份证编码优化结果然后送到GenScript合成。

质粒转化pRSET-HIV Id

转换方法是指热休克的方法(4),使用的宿主细胞是大肠杆菌BL21 (DE3)。

质粒隔离

的质粒从生物隔离使用质粒进行隔离工具基本[Geneaid]。

质粒的确认

PCR方法:转换后的质粒所证实聚合酶链反应方法。的聚合酶链反应概要文件用于放大AraC-HIV Id为基因在95ºC 3分钟predenaturation和变性95ºC,持续30秒。然后退火或主要依恋阶段发生在温度为30秒56ºC,继续与拔节期温度72ºC 1分钟。这个放大的过程持续了25周期。后25^th周期,进行最后的72ºC伸长了7分钟。的聚合酶链反应结果电泳。主要序列使用底漆

5 'ctggaaaggatccatggataatcgggtacgc 3和反向5 'catagcaccatggttcatactcccgccattcag 3。

测序方法:通过测序是通过发送确认样品的质粒分离结果测序服务公司Macrogen inc .)在首尔,韩国。主要使用排序是正向引物5 'taatacgactcactatagg‘3和反向引物5’CATAGCACCATGGTTCATACTCCCGCCATTCAG‘3。测序结果利用T-COFFEE处理软件。

结果

质粒构建

基于专利P00201704939号解释说,这个系统由一个基因可以产生的融合蛋白调节器比喻AraC大肠杆菌抑制因子和报告基因的翡翠绿色荧光蛋白融合蛋白监管机构的监管。在这项研究中,融合蛋白调节器比喻代替艾滋病毒Id。

PCR证实

从聚合酶链反应electroferogram获得一个乐队在1076个基点的大小。这个乐队的大小对应于AraC-HIV Id为基因的大小乐队。这表明,含有AraC-HIV Id为基因质粒已经成功地改变了。

测序确认

进行测序分析确定DNA片段的序列的核苷酸序列和转换后知道发生的突变。基于图3众所周知,缺点的价值序列艾滋病毒Id和测序结果达到100意味着没有突变AraC-HIV Id为基因的核苷酸序列。

结论

在这项研究中,我们已经成功地构建的质粒AraC-HIV Id可用于开发一个高吞吐量的系统作为新的抗艾滋病药物的选择。

引用

1. 马迪根毫升,约翰毫米。生物学微生物。11的哦。普伦蒂斯霍尔。(2006)。
2. 王朱Lv Z, Y, Y。艾滋病毒蛋白酶抑制剂:回顾分子选择性和毒性。艾滋病毒/艾滋病(新西兰奥克兰)。2015;7:95。
3. Hayashi H, Takamune N, Nirasawa T, et al。二聚作用hiv - 1蛋白酶通过两个步骤涉及的机理发生蛋白酶二聚作用抑制内。美国国家科学院院刊》上。2014;111 (33):12234 - 9。
4. Hanahan D, Jessee J,布鲁姆FR。质粒转化大肠杆菌和其它细菌。在酶学方法,学术出版社。1991;204:63 - 113。