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优化Polyhydroxyalkanoate重组大肠杆菌生产的补充与不同植物副产品

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Polyhydroxyalkanoates (pha)是可生物降解的聚合物细菌合成在细胞质颗粒,如贪铜菌吊钩虫拿(Ralstonia eutropha),和其他细菌。pha积累发生在回应压力条件,即在高碳低氮(24:1比率)。在这项研究中,大肠杆菌在biofermentors PHA生产转基因。PHA合成细菌转化的操纵子phbA / phbB / phbC。细菌是美联储使用基础培养基补充了三个不同的植物副产品,土豆块茎皮肤水解,水解玉米和香蕉汁补充。biofermentor的增长是通过评估监控消耗糖类和量化的PHA合成。芯片扫描仪是用于读取荧光强度的蓝色尼罗河细菌染色。PHA生产大肠杆菌吃香蕉汁比所有其他的补充发酵媒体,最多每干电池PHA的重量。

关键字

生物降解;细菌;大肠杆菌;水解物

介绍

许多细菌物种,如chemolytotrophs贪铜菌吊钩虫拿(Ralstonia eutropha),会茁壮地生长和产碱杆菌属弦(1- - - - - -9),假单胞菌putida,铜绿假单胞菌(10- - - - - -14),p . pseudoflava(15)和其他假单胞菌spp [16),固氮菌vinelandii(17),Halomonas campisalis(18),肠杆菌属spp。19),栖热菌属酸奶(20.];枯草芽孢杆菌(21,22),蜡样芽胞杆菌(23)等,可以合成和积累和储存polyhydroxyalkanoates(pha)细胞内细胞器(24),co-composed hydroxypropionate,羟基丁酸和hydroxyvalerate,根据前兆的可用性(如辛酸)(11,25- - - - - -27)和中间化合物调节代谢通量对他们的合成,如柠檬酸。这些都是可降解的,生物相容性的和有用的生物塑料的生产。pha的基础生物塑料很容易塑造,具有良好的机械性能和瓶子和医疗设备的组件。pha是由细菌产生的氮限制(28),将碳源转化为能源存储。在生产biofermentors PHA的单程文化(29日,30.[],两批文化9,17,29日],馈料式[1,16,31日- - - - - -33文化[]高细胞密度1,34- - - - - -37和混合文化38- - - - - -40),以及水下和固态发酵流程(41]显示潜力有待开发生产方法(42]。

碳水化合物类股可能在连续注入发酵罐或提供确定时间点(馈料式),提供基质PHA生产(43- - - - - -46]。细菌细胞应对环境压力(压力、N、P限制)通过增加合成pha [10,47]。

PHA也已经产生大肠杆菌(48),使用基因工程(44,45,47,49- - - - - -57),通过细菌细胞工厂(58]。转基因大肠杆菌系统克服了氮限制的问题(38,46,59,60),需要改变生长培养基的成分。其他细菌物种已经使用了生物技术应用程序和基因工程等气单胞菌属hydrophila(61年]Halomonasspp。62年),突变体的假单胞菌putida(63年),铜绿假单胞菌(13),而芽孢杆菌spp。64年),或者使用其他生物技术系统(65年]。

重组大肠杆菌PHA生产快速增长,积累PHA干重的50% (38,66年- - - - - -69年),能够利用各种碳水化合物和中间体化合物(53,57,70年,71年]。几个因素(即。,type of feed, aeration conditions) influence the生物质增长率和PHA生产分子量大小。几个作者表明PHA生产使用大肠杆菌重组系统可以优化通过增加氧溶解介质,例如使用高速喷射和曝气72年]。

pha成本也可能取决于应用程序的类型,因为材料药物输送和医疗设备组件有高价值73年,74年]。主要的问题是原料的高成本,大约1美元/公斤的PHA,除了运营成本、提取溶剂和净化成本。在pha的工业生产中,超过50%的成本是由于碳水化合物基质。因此,使用植物副产品饲料细菌的新方法已经开发出来。甚至重要的研究是进行农业秸秆流销毁作为发酵原料。研究人员意识到一个高生产力的PHA的75年),而发酵过程使用C1碳源(76年,77年),甘蔗糖蜜(9,19,21,40,44,55,78年,79年],大豆糖蜜[80年),水果果渣和农业的和工业的副产品(52,81年),菊苣根(7,50],乳清,亚硫酸盐蒸煮液(82年),甘油(53,54,57,草出版社汁(36动物脂肪和植物油(),14,83年,3,16,8,13)微藻(71年和木质纤维素的原料26,34,35,38,53,58,71年,79年84年,85年]。

有需要减少生物反应器成本的优化发酵条件,优化PHA产量。的应用传感器在biofermentors主要设想监控细菌生长,营养水平,PHA生产的有效性。一个典型的生物反应器(即生物抑制剂问生物反应器系统)有三个基本的提供传感器监控的物理化学参数:温度探测器,pH值的传感器,探测氧张力。

最近一个代谢/聚合/宏观建模系统,评估流程变量,控制过程(即操作变量。、营养和曝气条件)来优化生物质生产速度,PHA PHA的积累和分子量86年]。各种类型的传感器可用于确定细菌浓度,能够量化细菌密度高。生物传感器全细胞细菌检测最近描述(69年,87年,88年]。

PHA生产工业发酵是一个临界点,因为保持最短的时间的过程可能在经济上是有利的。PHA PHA决心在细菌中筛选方法是基于尼罗红(λ激励:543 nm,λ排放:560 - 710)(89年)或尼罗蓝染色(82年,90年,91年]。最近,高度敏感和定量方法定量地读尼罗河蓝染色细菌已经开发,基于荧光测定术结合流动细胞(2],基于激光扫描仪(λexc 460海里/λ工作550海里,)荧光定量诊断细菌染色发现在微阵列的幻灯片(92年]。

在项目TRANSBIO欧盟委员会(92年)旨在从微生物PHA和有机酸的生产,我们测试了使用植物副产品的有效性降低工业成本发酵和PHA复苏。

在工业发酵PHA生产,设想三个设备监控以下参数:细菌生物质决心,b)量化碳水化合物的原料,c)水平的监测PHA生产在时间。建立了这三个参数的组合优化的使用生物反应器:使用时间(细菌生物量),和最大的合成PHA在发酵罐操作时间短。

细菌的生长在三个不同的植物副产品监控,即。土豆酶水解、玉米水解酶和香蕉汁、婴儿食品工业的副产品。发酵罐的PHA生产优化在三天内(在达到所需的生物质能)使用香蕉副产品饲料。我们监测细菌增长biofermentors媒体酸化,糖消费,细菌细胞密度、时间和数量的PHA合成:这个参数,使用的饲料类型,影响经济过程的相关性仪器的操作和运行时间的成本。

材料和方法

所有试剂都是优质的纯度(Sigma-Aldrich,默克密理博,达姆施塔特,德国)。

微生物和大肠杆菌质粒准备转换

一系列的Ralstonia eutropha选择环境隔离的能力产生大量的PHA,和用于控制和比较建立在生物反应器条件下产品的最高产量。

贪铜菌吊钩虫拿(Ralstonia eutropha)是用来放大phaCAB操纵子。大肠杆菌全球化学主管和大肠杆菌BL21 (DE3)化学主管(表达载体)。线性克隆pUC19向量(表达载体、ThermoFisher沃尔瑟姆,妈,我们)被用于克隆的基因通过同源重组。表达载体pET24b特点是强烈的混合T7 / LacO启动子(Novagen,默克密理博,达姆施塔特,德国)被用于诱导phaCAB基因表达。DNA提取一夜之间从一个细胞培养贪铜菌吊钩虫拿写明ATCC 17699使用DNA净化设备(Promega,菲奇堡,WI,美国)。

后聚合酶链反应放大的phaCAB操纵子缺乏本地启动子,聚合酶链反应产品是使用PureLink纯化聚合酶链反应净化设备(表达载体)和用于GENEART无缝的同源重组克隆和组装工具包(表达载体)。4100年英国石油公司放大phaCAB操纵子没有启动子的克隆在pUC19向量通过同源重组,因为这些引物共享终端的线性化向量。化学主管大肠杆菌全球细胞转化和镀磅板块包含100μg /毫升氨苄青霉素和5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside(半乳糖苷)蓝色/白色筛选。重组pUC19 /phaCAB向量(6700个基点)提取PureLink Hipure质粒Miniprep工具包(表达载体),消化生态国际扶轮和后第三限制性内切酶(37°C 2小时)和净化片段的结扎pET24b向量(5310个基点),以前相同的限制性内切酶的线性化。E。大肠杆菌BL21(DE3)细胞在磅转换和镀板包含50μg /毫升卡那霉素。殖民地的大肠杆菌表达重组向量被检测的选择phaCAB基因的聚合酶链反应质粒线性化之后。转换的几种方法大肠杆菌前面描述的,但很难重现相同的结果或相同收益率的PHA生产。

媒体和文化条件

重组大肠杆菌BL21(DE3)窝藏不等的phaCAB操纵子的贪铜菌吊钩虫拿写明ATCC 17699种植在30°C和150 rpm在馈料式的情况下,在500毫升摇动烧瓶开始卷150毫升,20 L生物抑制剂生物反应器(缝匠肌、哥廷根、德国)开始卷15 L .光密度(OD)被用来监测细菌生物量,通过维护一个40%氧饱和度恒流的压缩空气(2 vvm)和串级控制速度。pH值在6.9±0.1自动监测通过添加股票15% v / H₂所以₄和NH₄哦(20% v / v)。感应阶段进行添加半乳糖10毫米或乳糖30毫米25°C, pH值6.9和气流3 L / min后24 h,当细菌到达他们的固定相。喂养的解决方案是添加4毫升/分钟48 h。

馈料式水解媒体含有甜玉米水解酶10%,香蕉汁5%或土豆皮肤水解酶的25%是提供从TRANSBIO财团27]。甜玉米水解酶的糖含量,土豆皮肤浪费水解和香蕉汁所示表1。一个缓冲钠₂HPO₄/ Na₂阿宝₄×H₂O (pH值7)是用于初始增长文化。维持质粒稳定性、卡那霉素(50μg /毫升股票解决方案)是1:10 0添加到媒体。微量元素的解决方案(te)股票准备如下(g / L): 10 FeSO₄×7 h₂啊,2 CaCl₂×2 h₂啊,2 2 ZnSO₄×7 h₂O 0 5 MnSO₄×4 h₂啊,1 CuSO₄×5 h₂O, 0, 02年Na₂B₄O₇×10 h₂O和1%的测试工程师的解决方案是添加到水解介质。喂养的解决方案仅由水解介质;没有额外的糖补充道。

表1:三种酶组成玉米胚芽蛋白酶解物中使用这项研究(由TRANSBIO联盟伙伴)值。

量化的还原糖

细菌培养基中的碳水化合物含量是日常用蔗糖、果糖和葡萄糖工具包(Megazyme、威克洛郡、爱尔兰),通过哪个NADH量化其吸光度。这是使用microwell盘子和荧光谱仪读取在无限200 Pro 340纳米仪器(Tecan、Mannedorf、瑞士)。葡萄糖和果糖量化每12 h。酶反应可以确定消耗糖的水平。根据糖可用性、细菌停止生产PHA,因此额外的糖股票解决方案是biofermentor注入。基于糖的添加量股票解决方案维持细菌生长5天,这是估计的光学密度细胞在诱导合成PHA是25或更高。

的细胞生长摇动烧瓶和20 L生物反应器进行测量_600海里洗的整除,使用分光光度计(日本岛津公司,京都,日本)。

监控生产的PHA尼罗蓝染色和荧光定量

确定基于蓝色尼罗河的PHA涉及几个步骤,与酒精或丙酮固定,对染料渗透通过膜,需要几个小时和细菌从整除样品转移到埃普多夫管。PHA诱导后24 h后合酶的细菌生长的乳糖30毫米或半乳糖10毫米;生产被尼罗蓝染色每天监测。细菌培养的整除与MilliR H洗两次₂O和5μL用移液器吸取到干净的载玻片上,风干,热固定和染色尼罗蓝溶液10分钟55°C。三个整除为每个采样,做两个连续稀释的样本(1:2,1:3)。然后,下滑是清洗和8%醋酸30秒处理以去除污渍。载玻片的水洗,晾干,分析428年Affymetrix数组扫描仪,在激发460海里/ 550海里排放(图。1)。当信号达到最大荧光(白色信号,图。2),发酵停止,暂停离心机和PHA的颗粒干提取。

PHA提取

测量细胞内,直接细胞消化使用硫酸。特别是50μL中添加了500年μL 96%硫酸为水浴在95°C为30分钟98°C PHA被加热转化为巴豆酸浓硫酸。光度法测定在235纳米是由分光光度计(日本岛津公司)。纯polyhydroxybutyrate (PHB) (Sigma-Aldrich,默克密理博,达姆施塔特,德国)是用于校准曲线。PHA浓度聚合物被定义为克每升文化误事。

提取PHA、细胞裂解进行了使用酶消化。50μL溶菌酶(50毫克/毫升的股票,添加1:10 0)被添加和孵化1 h和30分钟后跟蛋白酶K(1毫克/毫升股票除了(1:10 0),留给3小时。然后,消化细胞材料转移30毫升熔融还原玻璃管。热添加了氯仿和样本保存在一个沸水浴2 h(涡流每10分钟)(图。3)。每毫克的小球,12日5μl氯仿和12日5μl 6%的次氯酸盐钠溶液添加到颗粒和孵化15分钟37°C。3000克进行了25分钟的离心去除non-PHA细胞物质和恢复氯仿低阶段,包含PHA。最后,固体PHA是通过添加甲醇(7:3 v / v的甲醇和水)对氯仿(5卷)和过滤(图3 b。)。

细胞干重(CDW)

细胞干重(CDW)采样体积的汤(5毫升)或整个文化发酵是通过离心5分钟,每分钟8000转,洗,其次是细菌升华干燥。干颗粒的重量是表达g / L。

结果

生物量增长PHA生产

重组大肠杆菌BL21(DE3)细胞,窝藏不等的phaCAB操纵子,生长在扩大实验之前到达biofermentor规模在20 L生物反应器,通过媒体含有植物碳水化合物,如甜玉米水解酶10%,香蕉汁5%,土豆皮肤水解酶的25%。没有添加葡萄糖和乳糖作为诱导物的表达PHB合成操纵子。24小时后,当达到细菌密度高,phaCAB操纵子诱导表达,在强大的混合T7 / LacO宠物系统的启动子,上瘾的乳糖或半乳糖(图。2)。以前一些作者利用乳糖作为诱导物。

此外,我们测试了相同的水解媒体使用自然应变,Ralstonia taiwanensis。有限基底表达重组在第一个小时pET /出租车大肠杆菌压力是存在的(绿色信号,图2 b。)。添加乳糖后,PHA合成检测(白色的信号,图2 d。)。评价聚合物合成、50μL介质直接消化500年μL 96%硫酸为30分钟热水洗澡;poly-β-hydroxybutyric酸被加热和转换为巴豆酸光度法测定进行了235海里。后离心去除non-PHA细胞材料,PHA被过滤和回收甲醇沉淀(图3 b。)。

当测试三种不同的农工的废物作为饲料,最好的结果观察细菌生长和PHA生产香蕉汁水解和重组菌株(表2和3)。自然应变Ralstonia taiwanensis,通常好的PHA生产商进行两阶段批量生产(营养培养基其次是限制媒介),当种植只在农工业的显示非常的浪费低收益率(表2)。

表2:Ralstonia种虫害和大肠杆菌水解PHA积累在三个馈料式媒体,72年之后h。一式三份的报告值意味着实验。细胞干重(CDW)。

表3:PHA合成通过大肠杆菌喂香蕉汁股票在biofermentors。

尽管在报告文学自然菌株的最佳PHA生产商,结果取决于介质组成。虽然不需要重组菌株在细菌中碳/氮不平衡,PHA合成在自然压力取决于精确的C: N比率。大肠杆菌pET /出租车能够产生PHA使用水解植物副产品。香蕉汁、5% (v / v)的最后的介质,特别是富含葡萄糖和果糖(89.80±0.5 g / L和82.24±0.4 g / L,分别)和氮(6 g / L);被证明是一个很好的媒介重组大肠杆菌使用优化PHA生产协议和发酵罐培养三天(表3)。

克服C: N失衡,葡萄糖浆、糖蜜作为碳饲料,生产成本的增加。因此新菌株,突变体或PHA生产工程,研究了全世界。最近的应用农业副产品、木质生物质油和C1碳潜力扩大生产pha降低成本。在这项研究中,三个不同的副产品进行补充的细菌的碳水化合物。然而,所示表4,前两个hydrolizates要求更高能源成本,并对多糖的分解酶。土豆水解物显示含有葡萄糖的含量最高,而果糖pha合成高可能是必需的。因此,香蕉汁副产品的生长的影响大肠杆菌由于均衡的还原糖含量(表4)。使用香蕉汁的另一个优点是其柠檬酸含量有关。事实上,利用可用的糖在中分为两个步骤。乙酰辅酶a,中间的中心碳代谢,是细菌生长所需,但用于生产PHA生物质已达到最大密度。PHA生产从乙酰辅酶a, phbA依赖两个乙酰辅酶a分子转化为acetoacetyl-CoA;柠檬酸的存在抑制了三羧基的酸(柠檬酸)循环,导致大部分生成乙酰辅酶a的转变对PHA合成糖酵解途径。

表4:的要求能源和输出可用还原糖的香蕉汁股票相对于其他植物副产品。酶水解混合物协议和孵化时间为每个反应是独一无二的。

pH值保持稳定在6.9±0.1 NH的加法₄哦(20% v / v)。另一个参数需要优化对细菌生长介质中的氧气的数量。以前,研究人员使用高通气率,促进细胞生长在第一个发酵一步,低通气率在第二阶段,促进PHA生产(17]。然而,各种策略提出了增加生物质和PHA生产29日]。基于馈料式文化,排水系统在生物反应器将是一个很好的策略,因为它消除了上层的耗尽营养和集中的细菌培养,减少过度增加体积更长和更有效的喂养。

使用重组的优点大肠杆菌是:快速增长和高细胞密度文化;高水平的PHA生产。这些因素都依赖于介质成分:富含碳源的营养培养基影响PHA产量以及生产成本。今天,生产成本的PHA大约有4 - 6美元/公斤,包括聚合物提取和恢复的成本(5,38]。PHA颗粒intraorganellar,机械或化学方法所需细胞破坏。W开发了一个基于酶提取过程溶解细菌紧随其后反复拔牙、中描述的材料和方法。

可能使用植物副产品如甘蔗糖蜜作为增长媒体使自然经济生产菌株的使用方便(19,52]。几个作者农业的和工业的废弃物用于PHA生产通过添加它们作为补充碳源合成媒体如磅或PCA,加上额外的果糖,葡萄糖或硫酸铵。在这项工作中,我们表明,优化的细胞生物质增长和PHA生产可能通过biofermentor实现传感装置集成,使用三个传感单元能够量化糖可用性、细菌生物量、PHA生产水平。这使得个别化关键糖需要能够维持细菌PHA生产,尤其青睐的香蕉果汁糖的存在。

细菌的生长在三个不同的植物副产品监控,即。土豆酶水解、玉米水解酶和香蕉汁、婴儿食品工业的副产品。发酵罐的PHA生产优化三天的PHA合成感应(72小时)使用香蕉副产品饲料(图。2)。我们监测细菌增长biofermentors PHA合成的糖可用性和水平。糖的快速消费在中(在对数生长期增长以及在PHA合成感应)导致了需要馈料式添加越来越多的香蕉汁发酵三天期间,直到幻灯片显示的染色PHA的饱和信号(图。2)。

为了进一步降低生产成本和避免选择质粒含有抗生素的使用大肠杆菌,设想未来的整合重组系统大肠杆菌染色体。T7启动子允许使用乳糖、乳清和乳制品生产过程中的副产品,作为表达重组的诱发因素大肠杆菌(93年]。

研究人员先前集成phaCAB操纵子5 cptacs发起人集群大肠杆菌染色体,创建一个系统的重复性高和稳定的超表达的启动子;细菌产生的工程积累PHA批细胞干重的23.7%发酵(61年]。其他生产纯(R) 3-hydroxybutyric酸(R3HB)葡萄糖,收益率为49.5%(最大理论产量的85.6%),集成的PHA的生物合成基因染色体的大肠杆菌(94年]。

有趣的是,研究人员产生聚(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) [95年插入的一个副本methylmalonyl我看变位酶和methylmalonyl我看脱羧酶基因成孔蛋白站点HalomonasTD08 2 -methylcitrate合酶(prpC^Δ)缺失突变体。他们观察到活跃转录起始站点和基因拷贝数HalomonasTD08更适合染色体工程,与大肠杆菌相比,PHA生产。

最近,传感器检测建立了在线测量的生物化学物质,使用核废料旁边种虫害微生物电极测定乙酸(96年]。结果显示细菌氧化醋酸使电极终端电子受体。当醋酸氧化细菌,产生一个电流信号。微生物电活性电影作为传感元素是有前途的传感器组件。可以测量的有机酸是丙酸,丁酸盐,和其他挥发性脂肪酸(VFA)。因此,在不同的环境和条件,实时在线监测VFA浓度已被证明是可行的97年,98年]。

目前,VFA使用离线测量,气体或液体色谱法方法。在线测量可以直接通过一个传感器的集成到流程中。电化学方法一般是一种很有前途的工具,实时测量,为当前或潜在给瞬时测量信号。但是,一个传感器元素是必要的,选择性的浓度。在发酵罐中,短链脂肪酸的测定,例如摘要,可能是有用的补充VFA的量化混合型PHA的合成。此外,复合碳水化合物的营养需要量的进步从植物副产品在重组大肠杆菌细胞描述了在生物反应器,生产poly-lactate-poly-butyrate [30.]。

讨论

在这项工作中,我们显示的微分要求三个植物副产品重组大肠杆菌pha在biofermentors饲料生产,是高度需要biobased生化物质。实验比较的数据Ralstonia种虫害和大肠杆菌生长在水解三源,所示表4,表明香蕉汁在PHA生产饲料是表现最好的饲料大肠杆菌,也是最好的饲料Ralstoniaspp。在检测的副产品中,香蕉汁显示包含PHA合成所需的营养,提供碳水化合物和中间碳。培养条件允许的实时监测优化细菌的生长和PHA合成的操作时间,利用的潜能生物反应器和运营成本最小化。最近,另一种出版物报道可行性使用香蕉副产品PHA生产(99年),等其他进程沼气生产、生物经济时代的两个主题主题。因此,这些努力可能导致更多的负担得起的和低成本的方法基于合适的PHA生产植物副产品和高效工程菌(One hundred.- - - - - -103年]。

使用细菌PHA生产者和廉价农工业的残留吸引了世界各地的商业利益目标工业可持续发展,特别是使用廉价的碳水化合物作为饲料。这项研究显示,重组的可行性大肠杆菌培养在生物反应器对PHA合成,通过监测糖消耗,决心PHA的PHA合成和量化。使用重组大肠杆菌细胞生长在香蕉汁副产品的香蕉汁变换,如在哥斯达黎加,可能降低的成本发酵PHA生产,减少香蕉果汁行业的运营成本。

合规和职业道德

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由欧盟委员会(European Commission),第七框架计划(欧盟FP7)之下TRANSBIO项目“从水果和蔬菜加工业副产品的生物转化成有价值的生物产品”,在289603年格兰特。

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