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新的生物技术方法生产治疗化合物(地衣,Stictic和Norstictic酸)的细胞固定化地衣Cladonia substellata Vainio

*通信:

佩雷拉EC伯南布哥大学地理学系,联邦大学的伯南布哥,Av。莫拉教授的“政府改造”,1235年,CEP 50.740 -530年,累西腓,PE、巴西、电话:55 (81)21268275;电子邮件:verticillaris@gmail.com.br

文摘

本文的目的是修改相关的最常见方法生产USN等等生物活性化合物由地衣Cladonia substellata合理化生态提供大规模。不同的细胞固定系统被化验,使用NaOAc作为在不同浓度生物合成的前体。介绍了新系统最常见,包括静态immobilizates孵化,生物反应器在旋转运动和连续流的前兆。他们明显提高USN的生产。此外,的那种固定系统可以产生代谢物的内容不同。减少的发生USN的发生NTI和STI酸细胞中洗是相关的。通过这种方式,修改固定技术导致这些代谢物的产量最高,和更好地利用的前身,但是它不显示任何重大影响配件的生产和/或降解的化合物的化学物种。我们的研究结果的基础上,美国海军和其他化合物从c substellata被kaolinite-immobilized连续流系统在大量生产,一般地,在一个集中的10.0毫米,使用NaOAc作为前体。

关键字

Cladoniaceae;地衣物质;生物反应器;高岭石;Bioproduction

缩写:NaOAc:醋酸钠;NTSI: Norstictic酸;STI: Stictic酸;美国海军(R):地衣酸(减少)

介绍

地衣或覆以地衣真菌共生有机体组成的,至少,一个真菌和一个光合作用(藻类或合作伙伴藻青菌)。该协会还包含一组独特的化合物与生物活性代谢产物的来源供人类使用。地衣合成,主要是由一个真菌各种生物活性次生化合物代谢,有时甚至是超过30%的干菌体质量(1]。他们发现水晶存款菌丝表面。几项研究显示,这些生长缓慢的生物产生多样化的次生代谢产物具有不同的生物活性2- - - - - -8]。USN地衣氧芴衍生物独特的发现,显示广泛的药理作用包括抗生素、抗病毒、antiprotozoal,抗炎,镇痛,抗增殖、抗氧化、抗癌活动8- - - - - -11]。利用地衣医学是基于事实,它们包含这些独特多样的生物活性物质。

几个世纪以来,地衣已经商业化探索作为调停者本质,强调USN与衍生品作为治疗性物质(6,11- - - - - -18]。在化妆品行业,几个从地衣酚类化合物,如atranorin,已被用于避免成熟皮肤(19),或USN,用于保护它从大阳光照射20.]。

自知识应用的地衣物质像USN制药和化妆品行业,大量的生物质收集从环境中提取、净化和商业使用这些生物活性化合物。这一事实构成问题,因为低地衣的增长导致生态系统中的定位困难。这样,地衣的大规模使用意味着在一个环境问题21]。针对地衣的巨大潜力,一些技术已经发展为了解决这个问题,作为共生体或组织文化和细胞固定(22]。因此,使用生物反应器使用非常少量的地衣生物质似乎是迄今为止最可行的选择快速、高效的生物活性化合物的生产。

细胞的技术固定地衣代谢物的连续生产,集中使用很少数量的菌体,以及使用自裹入生物合成的前体细胞在惰性矩阵能够合成这些化合物的大量时间。在这种背景下,佩雷拉et al。23诱导核糖醇的生产细胞的Cladonia verticillaris禁锢在海藻酸的球体,但前体浓度最高,钠bis-carbonate,提供了一种阳离子Ca之间变化⁺用于硬表面的球体包含孤立的细胞,和Na⁺。

通过这种方式,佩雷拉et al。24尝试一个新的陷阱矩阵,高岭石,避免核糖醇生产描述的交互。在这种情况下,作者NaOAc用于USN bioproduction固定化细胞的c . substellata。作者发现前驱诱导浓度的增加细胞在降低生产USN形式。自固定系统执行到一个玻璃柱,地衣细胞混合高岭石和NaOAc(前体)细胞发布在实验中产生的酚醛树脂。因此,它是可能的USN合成c . substellata细胞应该使用在任何代谢过程,除了其存储固定介质(24]。

基于效率的固定系统修复,或传统方法(24),这项工作的目的是介绍修改在此技术生产的高性能代谢物c . substellata使用新的生物反应器的设计

材料和方法

地衣物质

Cladonia substellataVainio收集Mamanguape区(帕拉伊巴东北部的Brazil-06 50°e 35°07 'w)。地衣的分类识别是实现使用标准方法,化学和形态叶状体字符,由作者之一(提到过佩雷拉)。干菌体的植物标本存放在大学联邦德伯南布哥(巴西),注册n 34.402°。

分离纯化制备有机提取物,USN

c . substellata(45 g)是连续浸渍和提交4拔牙与乙醚、氯仿、丙酮(P。99.5%的PA / ACS 1.000 ml-Vetec Sigma-Aldrich^®)索氏仪器在40°C 16 h。这一时期后,提取的滤纸过滤(9号绘画纸),然后蒸发rotaevaporator(闪蒸器- 115 v。Buchler仪器。李堡。美国新泽西)耦合到一个水浴(CT 246 CIENTEC)在40°C至干燥。

分离纯化分离,USN,醚提取物的分离柱的硅胶(70目- 230目)筛选了氯仿:己烷(80:20 v / v)溶剂系统[25]。产品的特性、醚提取物和纯化晶体分析了USN的薄层(TLC)和高效液相色谱法(高效液相色谱)。

制备固定化系统

程序和材料:c . substellata叶状体样品(干重10克)和50毫升轻轻的在中断砂浆双重蒸馏水,4层纱布过滤,滤液离心机在3.200 g×30分钟。颗粒混合,充分水化高岭石在干重(30克),以前与去离子水冲洗和干燥在烤箱(SOC。Fabbe,圣保罗/巴西)在40°C。在0.1 NaOAc解决方案准备;1.0和10毫米,pH值8.5。为生物反应器组装,使用颗粒(约1克干重)与高岭石混合干重(30克)为每个浓度下的NaOAc白光(125μmol m²年代¹)在室温(25°C±3°C)。

生物反应器在修复系统:混合物地衣/高岭石装上玻璃3列(125毫升)和30毫升NaOAc (0.1;1.0添加和/或10毫米)。列下保持静止的白光在室温(25°C±3°C)在整个实验期间根据佩雷拉et al。24)(图。1)。

生物反应器在旋转运动系统:混合物地衣/高岭石是放置在3玻璃管30毫升容量和30毫升NaOAc (0.1;1.0添加和/或10毫米)。管固定在板耦合的电机模型MT8-3 7421 (220 V到240 V)保持匀速旋转运动(5 rpm)在白光(125μmol m²。年代¹)在25°C±3°C在整个实验(图1 b。)。

在连续流生物反应器系统:混合物地衣/高岭石放在漏斗G4(7厘米直径。125克)和30毫升NaOAc (0.1;1.0和/或10毫米)最初添加和前体漏斗不断下降的同时恢复细胞洗(30毫升),描述一个连续流的前兆。白光下的系统维护(125μmol m²。年代¹)在室温(25°C±3°C)在整个实验(图1 c。)。

从固定样本中酚酸的提取和分析

的洗固定系统24、48、72、96和120 h;1和2个月的实验用有机溶剂提取。相同的体积(30毫升)的新鲜NaOAc解决方案取代了在每个细胞生物反应器在获得洗涤。酚醛部分分离的细胞洗,样本被放置在一个漏斗和处理2溶剂分离系统:30毫升的乙醚/乙酸乙酯(比例,v / v)第一提取和30毫升氯仿/乙腈(65:35,v / v)为第二次提取。有机相混合时表示。然后,分析了酚类提取物在254 nm和366 nm)分光光度法,薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(高效液相色谱)。

量化的地衣酚醛树脂

有机提取物的酚醛含量估计通过使用定量紫外分光光度法测定。吸光度测定,分光光度计(BIOCHROM,天秤座S 22)在254 nm和366石英电池(路径长度1厘米)。一个校准曲线绘制使用USN(默克公司^®)作为一个标准的酚类化合物(0 - 5毫克毫升¹)。结果表示为毫克的USN毫克¹干重。

薄层色谱法(TLC)

自然地衣的有机提取菌体,摘录固定(0.1毫克毫升¹),蒸发后,USN纯化,USN标准(默克公司^®)溶解在二乙基醚/乙酸乙酯或氯仿/乙腈和乙醚(0.5毫升),分别被应用于硅胶默克F254 + 366盘子和溶剂系统开发(甲苯/二氧六环/醋酸,180:45:5,v / v / v)。斑点的可视化在短期和长期紫外线波长下,254 nm和322 nm。在这个过程之后,盘子被喷洒H₂所以₄解决方案(10%)和加热30分钟50°C,斑点颜色反应(26]。

高效液相色谱法(高效液相色谱)

相同的材料提交TLC分析了高效液相色谱法测定所述Legaz韦森特,在日立色谱仪(655个房间,东京,日本)耦合到CG437-B紫外探测器设置在254 nm。分离,C-18反向阶段列MicroPack MCH-18 de 300毫米×4毫米,柏林,德国(默克公司^®使用之前,达姆施塔特,德国)。有机提取物细胞固定(1.0毫克毫升¹USN毫升(0.1毫克)和默克公司标准¹)开发的一个权力平等主义的模式使用甲醇作为流动相/去离子水/醋酸,80:19.5:0.5 (v / v)。其他分析参数:体积注射20 ? l, 0.16衰减,压力87 atm流量rate1.0毫升分钟¹在室温(28°C±3°C)。分析的结果是比较物质的保留时间列,和峰面积,以标准(默克公司^®)USN为参考。有机阶段被蒸发干燥;残留在1毫升的乙醚溶解和用于高效液相色谱分析。

图像分析

研究技术上修改的影响细胞bioproduction细胞洗固定使用立体显微镜系统结晶和观察。

统计分析

从生物样品分析的测量都是一式三份。统计分析的平均值之间的差异从不同的生物反应器系统使用多个条件进行方差分析测试其次是事后分析与图基的诚实的显著差异测试。差异被认为是显著p < 0.05。

结果与讨论

地衣共生状态,可以生产几个家庭的有机化合物,次生代谢产物开发多样生物的角色。这些化合物之间,最著名的是酚类从acetate-polymalonate通路27外),分泌真菌菌丝和结晶皮层形成一个屏障对紫外线辐射(28]。Legaz et al。29日描述,c . verticillaris发展更高的酶活动的光在黑暗中。这可能是同意的要求的光化活性chlorobionts维持乙酰辅酶a的池。因此,使用NaOAc前驱诱导细胞生产地衣代谢物,在光照条件下,允许藻类细胞光合作用。

建立生物反应器的最佳条件,3种不同浓度的NaOAc化验。苯酚生产的时间进程和分泌的不同固定系统。细胞洗的c . substellata固定化修复系统(图。2.1.a)显示高生产的酚醛树脂在第一次5天的潜伏期,减少到30天,并增加生产之后,主要是在10毫米NaOAc。图。2.1.b显示了酚酸浓度的时间进程中产生旋转运动系统。观察相同的生产高峰,但它不是通过增加NaOAc增加从0.1毫米到1.0毫米。高水平的酚酸得到10毫米NaOAc,被这对bioproduction浓度最有效。相同的行为观察细胞洗的c . substellata固定化在10毫米的NaOAc连续流系统,维护其在整个实验中连续生产。没有明显的产量为0.1毫米和1.0毫米NaOAc观察(图。2.1.c)。这些结果可以解释为短时间之间的联系LD乐动体育官网细胞和他们bioproduced代谢物。为解决这个问题提到固定系统,当细胞的c . substellata可以使用的生产物质代谢过程(23]。

基于这些结果,可以认为固定化细胞的c . substellata有能力生产酚类化合物。然而,不同的设计生物反应器(修复、旋转运动和连续流系统)的影响在bioproduction固定化细胞。高岭石固定化细胞连续流系统加载显示更好的酚类化合物的生产在10毫米NaOAc前体。

总生产的酚醛树脂c . substellata细胞2.2所示。修复系统表现出相当大的生产0.1 mM NaOAc减少1.0毫米,但最高的生产实现NaOAc 10毫米。在旋转运动和连续流系统中,没有观察到酚酸的生产0.1 mM的前体,低1.0毫米,显著增加10毫米。之间的显著差异发生在酚酸的生产系统固定类型和前体的浓度。因此,10毫米的浓度NaOAc是最有效的细胞bioproduction,连续流动,更好的使用系统。我们可以找到许多报告地衣提取物的抗氧化活性与高含量的酚类化合物,由于其清除自由基的能力如单线态氧、超氧化物和羟基自由基7,30.,31日]。因此,固定在连续流系统10毫米的前体似乎是最好的生物反应器生产酚类化合物的抗氧化活性。

前体浓度的影响产生的代谢物的内容可以从一个不同物种到另一个地方。而c . substellata增加其生产高浓度的NaOAc的函数(23),c . clathrata细胞显示在0.1毫米NaOAc更有效(32),而c . corallifera没有加强其生产、中期和前体浓度最高33]。在这篇文章中,可以观察到的那种固定系统可以产生代谢物的内容不同。

获得的酚醛树脂的化学成分细胞洗的固定化c . substellata决心用TLC和HPLC-UV分析。这些提取物中的主要酚类化合物:USN,其减少的形式,NSTI酸STI (图。3- - - - - -5)。他们所有的人都生物活性化合物(4,5,11,34,35]。美国海军是由几个物种地衣和它在地衣属是一种常见的代谢产物Cladonia。自1844年首次隔离,USN已成为最广泛研究地衣代谢物和为数不多的商业应用。的缩酚酸环醚NSTI和STI广泛lichen-forming真菌产生的次生代谢物。像其他地衣物质,其中大部分是作为晶体沉积在地衣的质外体,而只有一小部分溶于水。出于这个原因,他们通常可以从地衣通过分离有机稀释剂。

通过薄层色谱分析可以观察到的样本c . substellata收集在巴西生产的高含量的USN (图。3- - - - - -3 c)。在首次与二乙基醚/乙酸乙酯萃取,细胞装满0.1毫米,1.0毫米,10毫米NaOAC维护修复系统,USN只是检测(图。3)。之后第二个与氯仿/乙腈提取,这是观察USNR生产NaOAc浓度,和2个额外的斑点,可能STI和NSTI酸。STI现货中检测出细胞保持在1.0毫米NaOAc耐洗和NSTI现货0.1毫米(图。3)。TLC的有机提取物在旋转运动和连续流系统中,显示增强的斑点的USN USNR,除了2额外的斑点,可能是性病和NSTI酸(图3 b。和3 c对所有NaOAc浓度)。最后只酚醚/乙酸乙酯提取,根据eluotropic使用的溶剂系统提取的能力。这可能是NTSI酸与二乙基醚/乙酸乙酯提取,而STI酸与溶剂系统。的细胞固定在旋转运动系统中显示额外的现货,USN附近,可以其他执法化合物物种(图3 b。)。特别是,强大的破坏分子内氢键的USN增加的整体hydro-solubility分子,从而产生更多的用小射频值极性活性化合物。衍生品的USN应该视为潜在化合物的进一步优化与生物活性物质(36,37]。

检测出现清洗解决方案,这些酚酸的高效液相色谱分析。美国海军从菌体提取物(高效液相色谱分析中发现图。4)。的图。4展品的峰值标准USN,注册在15.7分钟。原油提取显示相同的峰值为15.6分钟,和其他在15.9分钟,17.1分,分别对乙醚、氯仿和丙酮提取物(图4 b。- - - - - -4 d),氯仿显示更高的USN与其他溶剂的萃取能力。在同一图中,一个额外的峰值为3.5分钟对应于乙醚过多用于解散标准USN和原油提取。这种化合物被用作内部标准。这个峰值时增强提取极性增加,可能由于大量的辅助成分。这种地衣物种被描述为丰富的USN,也包含这些酚类以及cryptostictic酸作为附件提到的化合物(38),还发现在TLC分析(图。3)。

每个化合物的一些特点,包括他们的保留时间价值和范围的浓度(%)所示表1。高效液相色谱分析显示,USN USNR, STI和NSTI是主要的化合物在细胞产生固定地衣的c . substellata(图。5)。这些化合物的保留时间值变化从2.7±0.5,15.9±0.9分钟(表1),而这四个代谢物的浓度范围是相似的。NTSI显示更高的范围(大约50%),而USN的数量、USNR和STI略低(约30%)。

表1:每个化合物的一些特点,包括他们的保留时间价值和浓度(%)的范围。

地衣是可能的次生代谢修改生产配件的化合物(STI和NSTI)什么时候细胞是固定的,因为STI和NSTI (图。5)没有发现有机提取物的叶状体(图。4)。一些不同的化合物的生产菌体和固定化细胞可以依靠的共生体之间的依恋。这可能是地衣收集在潮湿的区域显示apressorial接触,LD乐动体育官网物种从巴西东北半干旱地区喜欢吸器的接触(LD乐动体育官网39]。

相对于bioproduction效率,不同化合物的内容取决于类型的细胞固定系统,因为旋转运动和流动系统显示更高的观察值。然而,有必要了解,由高效液相色谱分析的样本是有机提取物的混合物和山峰解决一些样品并不总是令人满意的。因此,高效液相色谱分析的目的是确认的存在生物活性化合物检测到TLC知道他们总bioproduction的范围。

地衣化合物作为抗癌药物的重要性近年来已被证实。STI可以被认为是一个有前途的先导化合物的设计新颖的人类结肠癌腺癌药物(17),也引发神经保护通过他们的抗氧化能力。这意味着他们可以使用的可能性的氧化损伤相关的神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症(40]。

USN生产由我们3系统的增强也批准通过结晶获得USN从细胞洗(图6。),连续流动的地方固定系统显然是最好的USN生产,10毫米NaOAC (图6 c。)。的水晶细胞的耐洗固定系统,保持在10毫米NaOAc,表现出不同的权重。从修复系统,结晶USN显示3毫克的收益率,在旋转运动5毫克,在连续流动和7毫克,批准技术修改bioproduction效率的影响。

酮化合物的生物合成途径似乎(全部或部分)负责USN, STI和NTSI酸。然而,他们的生物技术生产经济的可持续发展需要一个过程。以前的净化足够的酶和底物的化学制备非常昂贵的用于工业规模。有一个极大的兴趣寻找新的系统,可以生产它们,因此使用固定化细胞基本上与醋酸是一个过程充分补充快速、准确和可再生的产生这样的地衣化合物在半成品级别。

通过这种方式,修改的固定技术促进了最高的生产细胞和更好的使用前体NaOAc,但这并不影响化合物的物种的生产。从细胞immobilizates这些代谢物的生产,没有使用大量菌体数量,是一种约定的技术bioconservation和自然资源的可持续利用,强调地衣的增长非常缓慢和重新定位生态系统非常困难的(21]。

结论

可能说的USNc . substellata是由连续流系统,一般地,在10毫米NAOAc作为前体。此外,其他活性化合物,如STI和NTSI酸,在实验条件下生产测试。新固定生产系统生物活性化合物被验证。

确认

报告的作者之一(e·c·佩雷拉)感谢国家科学和技术发展委员会(CNPq)个人奖助金和金融项目支持。

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