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隔离和表征的磷酸盐增溶的咖啡树从根际细菌和评估他们对咖啡幼苗的生长和发育的影响

*通信:

普拉萨德Dhurva Gauchan、生物技术、Kavre,尼泊尔,加德满都大学电子邮件:gauchan@ku.edu.np

文摘

6个月大的根际土壤样本收集咖啡幼苗。磷酸盐增溶的细菌(公安局)是根据定量选择磷酸溶解能力通过测量周围明确区殖民地Pikovskaya的琼脂。总共26公安局被孤立。最好8隔离(公安局,公安局,公安局,公安局,公安局,公安局14日,公安局19日和公安局20)选择和表型和生化特征。最好选择四个隔离发芽试验,幼苗生长实验和温室实验。咖啡的接种的公安局对发芽的影响种子体外评价,结果表明,所有隔离(11 10 1公安局,公安局,公安局,公安局20)增强发芽未经变质处理的水控制51.72% - 58.82%。在幼苗生长实验中,隔离公安局20分离显著提高拍摄长度和鲜重。在温室实验在5月里,隔离公安局20和公安局1显著提高咖啡幼苗拍摄长度,新鲜的拍摄生物质和新鲜的根生物质在未经变质处理的水控制植物。公安局1和10显著增加了叶绿素含量和公安局蛋白质含量在咖啡叶子。所以,这项研究表明bio-inoculants能够刺激植物生长,并建议进一步的实验现场条件

关键字

咖啡;磷酸溶解;磷酸盐增溶的细菌;Pikovskaya媒体;根际

介绍

磷(P)是一种植物生长所需的重要元素,是涉及到许多植物代谢功能(1,2]。与其他主要营养相比,P是迄今为止最移动由于磷酸盐离子的大反应相对于大量的土壤成分,因此经常植物生长的限制因素(3]。P在土壤中磷灰石等矿物形式存在,羟磷灰石和氧磷灰石,在磷酸肌醇等有机形式,phosphoesters,不能被植物直接吸收4]。大部分可溶性无机磷肥开采不可再生磷酸岩来源。应用于农业土壤的磷肥降低P不足,然而,也迅速固定,无法控制植物和土壤的酸度增加,降低了土壤有益微生物的人口(5]。此外,土壤P来源于肥料转移的一个主要原因是P-induced表面水的富营养化6]。在不断增长的对粮食生产的需求,有一个巨大的挑战当前农业的可持续性实践,和磷安全正在成为一个全球可持续性的挑战。因此,有必要需要一个可持续磷使用农业(5,7]。

的便宜和环境安全的替代品之一提高磷的缺乏营养的操作是磷酸根际的增溶的细菌(公安局)8]。公安局能够释放可溶性P土壤中无机和有机来源通过溶解和矿化,从而促进植物生长(9]。除了增加P释放,公安局也起着重要的作用在植物生长促进生产吲哚乙酸(IAA)、ACC脱氨酶含铁细胞,抗生素、氰化氢(HCN)和exopolysaccarides。许多公安局包括物种的假单胞菌、Azospirillum固氮菌、克雷伯氏菌、肠杆菌属、产碱杆菌属、节细菌属、洋葱,芽孢杆菌,根瘤菌和沙雷氏菌属已报告来提高植物生长在许多商业上重要的农作物(10]。

尼泊尔mid-hills咖啡是一个新兴的经济作物和经济利润更丰厚的比任何其他经济作物和粮食作物。尼泊尔咖啡是有机,种植不使用化肥和农药的11]。生产和缓解低输入要求意味着即使边际土地适合咖啡生产,特别是适合农民失去了充足的资源。目前,它是生长在尼泊尔的40多个地区1760公顷,和超过27000个家庭参与咖啡农场。据估计,1.1公顷的土地适合咖啡农业(12]。尽管巨大的潜力,缺乏商业化和生产力的尼泊尔咖啡依然贫穷相比其他国家(13]。

咖啡根际与大量的有益的微生物包括公安局可能导致植物的营养需求。本研究的目的是隔离,描述并确定磷酸的能力使溶解细菌与咖啡植物的根际和访问公安局咖啡幼苗生长的影响。

材料和方法

采样地点

根际的土壤样本收集从6月咖啡幼苗生长在喜马拉雅有机咖啡,Khawa Kavre、尼泊尔。

土壤采样、隔离的公安局和维护

根仔细连根拔起及其根际的土壤完好无损。大部分土壤被剧烈摇晃手工删除从植物10分钟。握手收集的根际的土壤根一升10分钟的无菌0.9%氯化钠溶液(14]。土壤孕育了悬挂在轨道瓶瓶25分钟在100 rpm 30°C。随后的悬架是连续稀释。1毫升溶液被稀释到稀释10 - 6和0.2毫升每个稀释是放在Pikovskaya琼脂(PKA)板块和培养5天在30°C。磷酸的存在使溶解细菌的形成表明了透明(晕)区在殖民地PKA琼脂板上。殖民地与大晕区,选择不同的形态和纯化获得纯培养。隔离是保持在40% (v / v)甘油-20°C进行长期存储。

评价磷酸增溶的细菌(公安局)

公安局隔离进一步筛选Tri-Calcium磷酸盐(TCP)和磷酸岩(RP)增溶的活动在琼脂板上。纯文化的磷酸盐增溶的细菌被发现接种的中心Pikovskaya琼脂培养基,NBRIP琼脂媒体和NBRIP-RP(摩洛哥5 g / L RP) [15,16]。板块在30°C了10天,孵化区域的磷酸盐溶解形成的殖民地都被记录下来。分析磷酸增溶的能力是由测量溶解在殖民地的区域增长增溶指数(SI) (17]。实验进行了一式三份。

公安局隔离进行了进一步分析的能力磷酸溶解在汤中。250μL培养液分离株接种Pikovskaya肉汤,NBRIP肉汤和NBRIP-RP (5 g / L摩洛哥RP)肉汤(100毫升)的锥形瓶,在120 rpm颤抖的孵化器孵化了10天30°C。无菌未经变质处理的介质作为控制。文化是在10000转离心收获而10分钟,使用离心机。总可溶性磷酸盐在文化上层清液用紫外可见分光光度计在420纳米以下vanadomolybdophosphoric酸比色法18]。

形态学和生化特征

有效公安局被确定基于形态学和生物化学特征。公安局的标识隔离根据菌落形态,公安局隔离是生长在营养琼脂板24小时30°C。克反应是使用HiMedia革兰氏染色工具包(K001-1KT)根据制造商的指示。柠檬酸吲哚试验、MR-VP测试和测试执行根据Hemraj et al。19]。

公安局对咖啡种子萌发的影响

公安局对种子萌发的影响研究了接种的种子Coffea阿拉比卡最好的四个隔离。c·阿拉比卡种子收集从当地咖啡合作。内果皮(羊皮纸)手动删除(20.]。然后种子表面消毒1%次氯酸钠为1分钟和双蒸馏水清洗三次21]。准备的细菌培养液,隔离首次有营养琼脂板和孵化30°C 48 h。单一的殖民地NA盘子是用接种环,转移到250毫升营养肉汤和长耗氧旋转瓶在160 rpm 30°C 24 h。细菌悬液保持在OD550 = 0.5 - 1

对于bacterilization,种子浸泡在细菌悬液。细菌悬液是排水和种子干一夜之间在层流罩(22]。种子被放置在无菌培养皿滤纸,培养7天30°C的孵化器。种子浸泡在蒸馏水和媒体(HiMedia营养肉汤)被用作控制治疗。种子的发芽率是记录。实验进行了一式三份。

公安局对咖啡幼苗生长的影响

评估公安局对咖啡幼苗生长的影响,c·阿拉比卡种子内果皮(羊皮纸)完整的表面与1%次氯酸钠消毒1分钟和双重蒸馏水洗了三次在细菌悬液中浸泡24小时(OD550 = 0.5 - 1)。细菌悬液是排水和种子在层流罩干燥过夜。种子浸泡在蒸馏水和媒体(HiMedia营养肉汤)只被用作控制治疗。对制备无菌土壤,田间土壤是热压处理过的两次20分钟在120°C, 24小时间隔。无菌土壤在塑料广场塞托盘。有10个种子/治疗。治疗是基于完全随机设计和放置在标准实验室条件25°C。试验装置是天天浇水,没有额外的肥料了。70天的播种后,拍摄长度、根长度、射击鲜重、根鲜重、叶绿素含量和蛋白质含量咖啡幼苗的测量。叶绿素从树叶中提取和估计被亚嫩河,194923),而蛋白质含量叶子和种子的估计蛋白质含量叶子和种子的估计是被洛瑞et al。24]。

公安局对咖啡温室条件下植物生长的影响

植物生长促进能力最好的四个公安局隔离评估c·阿拉比卡在温室条件下幼苗在锅。四个月的老苗的根c·阿拉比卡背井离乡,清洁,和根表面使用酒精消毒。细菌培养液是如上所述准备的。根被细菌悬液中浸泡10分钟,并转移到锅12厘米高度和直径9厘米。锅含有600克的两次热压处理过的土壤和50克木灰。执行的实验是在一个完全随机设计有五个复制/治疗。未经变质处理的植物被用作负控制和植物处理商业级单超级磷肥(16%水溶性P205, 11%硫、钙21%)被用来作为积极的控制。咖啡植物被安置在温室条件下,每交替天浇水。观察了在拍摄长度、根长度、射击鲜重、根鲜重、叶绿素含量,蛋白质含量最后五个月。

统计分析

从体外生成的数据,使用ms excel温室实验进行了分析。治疗效果在幼苗生长实验和温室实验分析了方差分析和手段是使用图基的测试相比,在5%的显著性水平。

结果与讨论

公安局的隔离和生化特征

由于其丰富的植物根际养分各种土壤细菌的可用性是一个热点。26公安局隔离获得根际的咖啡当镀Pikovskaya琼脂媒体(表1)。

表1:增溶指数(SI)的公安局隔离从咖啡树的根际分离Pikovskaya吗?琼脂板,计算的比率光环直径(毫米)/菌落直径(毫米)。

公安局隔离进一步表现为一系列生化反应(表2)。生化分析显示所有细菌为革兰氏阴性。革兰氏阴性细菌主要的咖啡树的根际研究25,26]。进一步的生化试验显示更大的假单胞菌的公安局隔离物种的相似性。假单胞菌物种是免费的生活和最丰富的土壤中,可以轻松地培养体外,从而更常见。

表2:的形态和生化特征公安局隔离从根际分离的咖啡植物。

磷酸溶解指数的隔离Pikovskaya琼脂板

每一个公安局的增溶指数分离Pikovskaya琼脂板提出了表1。结果显示不同程度的磷酸溶解从1.20到1.88不等。形成的光环Pikovskaya琼脂媒体是由于生产不同的有机酸和酸性磷酸酶的公安局隔离(9]。

公安局的评价在不同的不溶性磷的来源

磷酸盐增溶的细菌表现出多样的不溶性的提高溶解度P[来源27]。在我们的研究中,只有8隔离高磷酸盐增溶的能力在Pikovskaya琼脂(SI > 1.60)被选为评价溶解效率NBRIP琼脂媒体和NBRIP-RP琼脂(5 g / L摩洛哥RP), Pikovskaya肉汤,NBRIP肉汤和NBRIP-RP汤(5 g / L摩洛哥RP)。

周围8隔离显示清晰的光环带他们的殖民地。公安局,公安局8和公安局10显示最大溶解指数Pikovskaya琼脂(1.88±0.08),NBRIP琼脂(2.01±0.10)和NBRIP-PR琼脂(2.79±54)媒体分别是(表3)。

表3:溶解指数(SI)的公安局隔离在不同的不溶性磷的来源,这是计算比率的光环直径(毫米)/菌落直径(毫米)。

释放的可溶性P量10天后孵化了表4。不同程度的增溶的不溶性P来源不同的隔离是多种多样的。

表4:由不同的公安局隔离在不同的不溶性磷酸溶解P肉汤媒体来源。

孵化后10天在肉汤培养基,分离公安局10显示最大磷酸溶解Pikovskaya的(407.5±2.50μg /毫升)和NBRIP-RP(263.33±2.92μg /毫升)而孤立公安局11最大溶解指数NBRIP琼脂(529.17±6.14μg /毫升)。

许多研究人员报道了10多天的潜伏期,甚至多达15天是最佳的磷酸盐溶解各种细菌隔离(28,29日]。晕的形成区在琼脂板和P溶解在液体培养可以相互矛盾的15]。

公安局对咖啡种子萌发的影响

所有四个公安局隔离对咖啡有积极影响种子萌发与水和媒体控制。公安局1(68.00±2.00)和公安局20(63.33±9.89)显示咖啡种子萌发的最佳结果。Bacterilization咖啡种子会导致更大的建立这些公安局隔离在这个利基市场有竞争优势利用大量的代谢分泌物,从而提供防止潜在的病原体(30.,31日]。类似的积极影响种子萌发的磷酸盐增溶的细菌是较好的豆子和观察中投arietinum(32,33)(表5)。

表5:公安局隔离的萌发的影响Coffea阿拉比卡种子后10天。

方差分析测试显示平均值的根长度、根鲜重、叶绿素和蛋白质含量没有显著差异(p < 0.005)。幼苗生长实验显示隔离公安局20显著增加拍摄长度(6.12±0.06厘米)和拍摄鲜重(0.437±0.0146厘米)(表6)。

表6:公安局隔离效果阿拉比卡咖啡播种的幼苗后70天。

公安局对咖啡温室条件下植物生长的影响

方差分析测试显示根长度的平均值,也没有。叶子没有显著差异(p < 0.005)。温室5个月后实验结果表明,接种与磷酸盐增溶的细菌显著提高拍摄长度,新鲜的拍摄生物量、根生物质和未经变质处理的咖啡幼苗叶绿素含量。他们的效果是类似的或大于化肥控制。所有公安局隔离显著增加拍摄长度和新鲜的拍摄生物质咖啡幼苗。隔离公安局20显示最好的效果拍摄长度(16.1±0.71 g),新鲜的拍摄生物质(5.6335±0.1999 g)和新鲜的根生物质(4.3154±0.3322 g)咖啡幼苗(表7)。隔离公安局1和公安局11显示第二和第三最佳效果拍摄长度和新鲜的拍摄生物质咖啡幼苗分别。类似的茎干重和叶片干重增加咖啡植物接种公安局隔离据报道在咖啡25]。增加生物质由于磷酸治疗使溶解细菌已被报道玉米(34]和mugabeen [35]。这可能归因于公安局在根际的活动通过释放可溶性P也通过释放IAA, ACC脱氨酶,含铁细胞、抗生素和HCN [10]。光合色素,叶绿素含量提高的咖啡植物的根与公安局剂治疗。公安局1和公安局20显示,叶绿素含量显著增加,这可能表明交互触发叶绿素增加叶绿素合成相关酶(36]。同样,公安局10显著增加蛋白质含量(0.232±0.03毫克/克)咖啡叶子。

表7:公安局隔离在不同生长参数的影响Coffea阿拉比卡5个月后,在温室条件下。

咖啡幼苗生长和推广可以归因于许多机制,通过直接和间接,根际细菌有助于可持续发展的促进植物生长。一般来说,有益的根际细菌贡献通过合成特定的化合物对植物或促进特定从土壤中养分的吸收或预防和保护植物免受病原体37]。

结论

Coffea阿拉比卡根际是一个热点,许多磷酸盐增溶的细菌。这些公安局可以溶解不同P不溶性形式的来源,因此可以作为生物肥料在可持续和有机农业系统。在现在,26磷酸盐增溶的咖啡树从根际细菌隔离。这些分离株表现出不同程度的磷酸盐增溶的能力。体外和温室试验结果表明显著改善咖啡幼苗公安局孤立对待。隔离,公安局20表明磷酸盐溶解和植物生长促进的独特的特点,因此有很大的潜力作为生物肥料在咖啡幼苗生长。使用本土的磷酸根际的增溶的细菌可以成为一个可靠的选择低资本农业和可持续发展管理P的使用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

这项工作进行的支持下KOICA(韩国国际合作机构),在技术上和经济上支持朝鲜合作者全北国立大学(CBNU)和加德满都大学(KU)。

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