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数量:16 (3):2022;16 (3):155在微生物学和传染性疾病诊断:扫描电子显微镜的使用
引用:巴克的大肠微生物学和传染病诊断:扫描电子显微镜的使用。纳米科技纳米Sci印第安纳j . 2022;16 (3):155。
文摘
在早期的研究中,电镜证明鉴别传染性疾病病原体的关键。这仍然是一个重要的技术诊断疾病和检测微生物鉴定。负染色,透射电子显微镜(TEM)一直被认为是“黄金标准”成像微生物样品,如诊断病毒学。Negative-stain TEM,另一方面,需要一个足够浓度的细菌细胞或病毒粒子表面吸附一层支持。微生物因此必须成长为高轮胎和/或由离心浓缩,这通常是不可能与病人的材料。结果,许多种类的微生物研究,电子显微镜在历史上低测试灵敏度。TEM识别代理如疹或多瘤病毒在患者标本,最低105到106粒子/毫升的浓度通常是必需的。相比之下,检测水平病毒利用文化或核酸测试通常从1到50粒子/分析不同。因为最近的过滤方法的进步,TEM和SEM病毒检测现在可能只有5000总粒子进行样本。此外,电子显微镜可用于确定的微生物,通常属水平,允许额外的专业测试(如引物或特定抗体)用于正确识别代理。的角度来看
在早期的研究中,电镜证明鉴别传染性疾病病原体的关键。这仍然是一个重要的技术诊断疾病和检测微生物鉴定。负染色,透射电子显微镜(TEM)一直被认为是“黄金标准”成像微生物样品,如诊断病毒学。Negative-stain TEM,另一方面,需要一个足够浓度的细菌细胞或病毒粒子表面吸附一层支持。微生物因此必须成长为高轮胎和/或由离心浓缩,这通常是不可能与病人的材料。结果,许多种类的微生物研究,电子显微镜在历史上低测试灵敏度。TEM识别代理如疹或多瘤病毒在患者标本,最低105到106粒子/毫升的浓度通常是必需的。相比之下,检测水平病毒利用文化或核酸测试通常从1到50粒子/分析不同。因为最近的过滤方法的进步,TEM和SEM病毒检测现在可能只有5000总粒子进行样本。此外,电子显微镜可用于确定的微生物,通常属水平,允许额外的专业测试(如引物或特定抗体)用于正确识别代理。
虽然是一个优秀的研究超微结构的工具,扫描电子显微镜(SEM)不如透射电子显微镜常用的微生物,如病毒或细菌。这里我们描述快速方法,允许完全水化,SEM成像不固定的微生物不使用传统的样品制备方法。我们证明改进的超微结构的保护,大大减少脱水收缩,标本包括细菌和病毒如埃博拉病毒病毒使用离子液体的渗透为扫描电镜进行过滤基质。
细菌的生长
Senftenberg沙门氏菌菌株在3毫升磅肉汤培养过夜37°C用颤抖的(请乔治•戈尔丁博士捐赠的国家微生物学实验室)。50 l的细菌被亚文化为三个毫升磅肉汤和培育4 h在37°和摇晃的近似mid-log阶段发展。细菌被固定在室温下1 h 1:1 v / v 1%多聚甲醛和2%戊二醛溶液。罗宾博士林赛的国家微生物学实验室优雅了钩端螺旋体biflexa型Patoc,麦卡洛在Ellinghausen和培养基培养修改约翰逊和哈里斯(EMJH)(荷兰皇家热带研究所)。受感染的文化是保持在30°C被存储在前14天低在室温下光。
SEM图像分析
所有样本扫描jcm - 5700便携式生物防范笼使用扫描电子显微镜(美国马JEOL美国、皮博迪)(AB Dycor科技有限公司,埃德蒙顿,加拿大)。在6 kV高真空下,黄金涂层标本拍摄了8毫米镜头光圈30米距离和工作目标。二次电子探测器用于图像;每个图像是2560 x 1920像素像素和160秒了。上述参数被用来创建图像的离子液体染色样品,除了加速电压增加到4 kV。图像捕获使用扫描电子显微镜放大3000倍到20000倍。
准备和TEM样品的成像
碳涂层400 -网铜网格,样本吸附formvar电影1分钟。吸附样品在蒸馏水冲洗三次,相比之下,2%的钨酸甲胺(Nano-W;美国纽约Nanoprobes, Yaphank)。一个范Tecnai 20透射电子显微镜用于图像样品在200千伏。(范公司晚宴过后,美国)。AMT的优势XR 12 CCD摄像机是用来捕捉数码照片的标本(AMT,丹弗斯、马、美国)。TEM照片被放大3500倍到19000倍。
长度测量的图像处理
埃博拉病毒的直径,Senftenberg沙门氏菌,钩端螺旋体biflexa测量使用直线工具和分析/测量函数在图像软件package34 J。酒吧照片和规模分析J /设置规模函数在图像被用来校准测量长度。因为细菌和病毒只有不同长度但一般均匀直径,直径在这项研究中进行测量。MS Excel是用来编译和分析数据。生物标本经常涂薄膜蒸发或溅射碳或金属在真空涂布机提供的导电表面SEM,需要初步脱水的标本。根据层沉积的厚度(通常2 nm-20海里),该涂层过程可以隐藏微小的超微结构特征。正常微生物标本,悬浮液的最小生物粒子通常在水中(100 nm大多数病毒,或者亚微米尺寸范围对许多细菌、真菌和寄生虫),这些标准方法很难实施。另一个问题是,微生物病人标本的兴趣或环境可能存在于样品低量,让他们发现在一个表面上的挑战。
扫描电镜成像金色涂布样品的准备
样品制备是在II级生物安全柜做除非另有注明。SPI-pore聚碳酸酯跟踪腐蚀过滤器(美国宾夕法尼亚州SPI供应,West Chester)被用来传递所有样品通过13毫米Swinnex®过滤装置(美国微孔,Billerica的)。细菌样品制备,0.08孔隙大小的过滤器被雇佣,而MVA和埃博拉病毒病毒准备利用0.05孔隙大小的过滤器。过滤器第一次湿3毫升Luer-LokTM注射器和2毫升杜尔贝科的磷酸盐(DPBS)。5毫升注射器,100毫升的样品加入5毫升DPBS示例加载到过滤器。
