研究

数量:15 (1)DOI: 10.37532 / 0974 - 7435.2019.15(1)全

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识别和描述的土著Hydrocarbonoclastic菌株Stenotrophomonas maltophilia新隔绝海水和海洋沉积物的西北阿尔及利亚奥兰港

*通信:

法伊扎Bendadeche实验室水产养殖和生物修复(AquaBior)、生物技术、自然和生命科学学院,大学的奥兰1艾哈迈德·本·贝拉,阿尔及利亚奥兰电子邮件: (电子邮件保护)

文摘

微生物在石油污染物生物修复有重要作用,造成巨大的担忧持续的毒性,致癌性,很难消除。在这项研究中,原油oil-degrading菌株SP54N隔绝污染海洋沉积物和海水在奥兰港,西北阿尔及利亚、使用Bushnell-Hass盐介质。这一毒株可以支持高浓度的原油10% (v / v)和被确认为Stenotrophomonas maltophilia通过测序和分析的16 s rDNA NCBI上的爆炸计划的网站。pH值的影响,温度、盐度对应变速率增长SP54N, BHSM中补充2% (v / v)作为唯一的碳和原油能源来源,进行了研究。结果表明,最大增长率在pH值获得7,温度25°C和3% (w / v)的盐度、140 rpm。此外,Stenotrophomonas maltophilia可以有效利用原油作为其唯一的碳和能源源。因此,Stenotrophomonas maltophilia SP54N可以作为很好的降能器开发一个环保和具有成本效益的方法生物修复奥兰港、土著细菌,和海洋环境污染的石油和石油碳氢化合物,生物技术的应用程序,可能是有用的。

关键字

生物修复;原油;16 s rDNA;海洋沉积物中

缩写

多环芳烃:多环芳烃;BHSM:布什内尔-哈斯矿盐介质;TSI: Triple-Sugar-Iron

介绍

芳烃和石油是最重要的环境污染物。碳氢化合物污染的海水和沉积物被视为国际威胁环境原因(1]。碳氢化合物污染港口和海洋环境排放的出现浪费产品加工、利用生产、开采、运输和储存的石油产品和石油泄漏事故。石油产品的放电环境中影响直接或间接导致的环境破坏生态系统和人类健康(2,3]。几种修复技术测试,以消除或减少烃污染物在最近几十年。生物修复是利用生物活动的一个重要战略的快速清除环境污染物(4]。已经证实,把应用程序更合适和实用石油碳氢化合物在港口和海洋环境污染1]。

生物降解的天然微生物种群是最好的可靠的机制来消除异型生物质污染物,像原油从环境中5]。Hydrocarbon-degrading微生物生活在海洋环境将更适应恢复烃污染大海。各种碳氢化合物降解菌分离等海洋环境Psychrobacter sp, Rodoccocus sp, Microccocus节细菌属sp,Spingomonas。然而,细菌的数量物种能够降解石油碳氢化合物从大海小于孤立隔绝沉积物(6- - - - - -8]。

多环芳烃(多环芳烃)是一组主要环境污染物异型生物质筹集大量的担忧有毒性、致畸性和致癌性9,10]。以前的研究证实,巨大的细菌、古生菌和真菌有石油降解能力11,12]。然而,这些微生物主要是与陆地土壤和沉积物以及海洋沉积物(13]。

我们的目标在当前工作是隔离土著hydrocarbonoclastic菌株降解原油的能力受污染的海洋沉积物和海水的奥兰港和描述应变SP54N对原油的高增长率。

材料和方法

样品收集

样品几毫米的海洋沉积物和海水表面的沉积物(-40米深度)收集,在无菌的玻璃瓶,在奥兰港,西北阿尔及利亚(35°42 44”N;0°38”28 W) (图1),2013年10月,立即运到实验室。

浓缩、隔离和选择hydrocarbon-degrading细菌

合成布什内尔-哈斯矿物盐介质(BHSM)是用于隔离hydrocarbon-degrading细菌(14]。pH值调整到7.2,然后由高压灭菌法灭菌20分钟的121°C。BHSM冷却后,补充了2% (v / v)的原油(Hassi-Messaoud炼油厂提供的、阿尔及利亚)作为唯一的碳和能源源。原油是由0.22μm消毒过滤膜。

从混合沉积物和海水(-40米深度的)2 ml被倾析后,并将其添加到包含BHSM 100毫升、500毫升锥形烧瓶和培养7天25°C在每分钟140转(rpm)瓶孵化器(Heidolph Inkubator 1000加上Heidolph Unimax 1010年,德国)。浓缩的文化产品,1毫升整除被转移到新鲜BHSM媒介随后的亚文化。然后,1毫升瓶都有一系列的接种物四种BHSM进一步亚文化中补充了4%,6%,8%原油10% (v / v)先后作为唯一的碳和能源源。每个亚文化在30°C和140 rpm孵化72小时。剂瓶的10% (v / v)原油飞跑到BHSM琼脂培养基补充10%的原油(v / v)和孵化25°C 3至7天。表型不同的殖民地在营养琼脂培养基纯化(Sigma-Aldrich,德国)。纯文化被接种一次新鲜BHSM中有10% (v / v)可以肯定的是,它以原油为唯一碳和能源源,然后储存在-20°C到特征。

形态学和生化特征

典型的应变SP54N的生化和生理特点,包括革兰氏染色法、运动性(甘露醇流动介质)、呼吸类型(meat-liver琼脂),柠檬酸Triple-Sugar-Iron测试(TSI测试),利用测试(西蒙斯的柠檬酸琼脂),系统地分析了根据细菌学[Bergey手册的决心15]。所有媒体都从Sigma-Aldrich购买(德国)。氧化酶活动是由装备氧化酶试验(Sigma-Aldrich、德国)和过氧化氢酶活性是由泡沫形成3% (w / v)过氧化氢溶液。下面的所有生化测试进行了一式三份。

分子识别

DNA提取:SP54N菌株的基因组DNA提取细胞使用一个EasyPure®细菌基因组DNA工具包(TransBionovo有限公司,中国)按照制造商的指示。DNA样本存储在-20°C到使用。

16 s rDNA基因序列分析:用作模板DNA样本聚合酶链反应放大16 s rDNA基因的使用通用引物ben27F (5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTC-3 ')和ben1492R (5 ' -GGTTACCTTGTTACGCTT-3 '),合成了σ(德国)。16 s rDNA基因与以下混合物:放大2μL DNA模板(20 ng), 1μL ben27F(25μM), 1μL ben1492R(25μM), 1.0μL核苷酸(5毫米),4.0μL MgCL₂(25毫米),5μL 10 x缓冲溶液(20 mM), 0.5μL Taq DNA聚合酶(5μL¹),50μL ddH2O期末卷。聚合酶链反应条件描述如下:95°C 5分钟;35周期,94°C 1分钟。聚合酶链反应产品是通过运行1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检查。这16 s rDNA被Genewiz部分测序。序列相似性搜索的国家中心生物技术信息爆炸。分析16 s rDNA基因序列数据进行使用Clustal W和软件包兆(分子进化遗传学分析)7.0版(16,17使用neighbor-joining方法)和种系发生树都是被推断出来的。

影响不同文化条件下的经济增长烃降解隔离

pH值的影响,温度和介质盐度的增长率应变SP54N调查使用BHSM介质和2% (v / v)的原油在140 rpm震动速度,在250毫升无菌烧瓶50毫升BHSM媒介。

在培养条件的影响的测试中,初始pH值在中调整到6.0,7.0,8.0和9.0和1 m盐酸或1 m氢氧化钠在25°C。孵化温度控制在20°C, 25°C, 30°C, 37°C,在pH值7和40°C。氯化钠的浓度在中调整到0%,3%,6%,9%,12%和15% (w / v) 25°C和pH值7。增长评估间接通过测量浊度(OD 600海里)分光光度计(珀金埃尔默λ35 UV / Vis分光计,美国)48小时后的孵化。

在培养条件的影响的测试中,初始pH值在中调整到6.0,7.0,8.0和9.0和1 m盐酸或1 m氢氧化钠在25°C。孵化温度控制在20°C, 25°C, 30°C, 37°C,在pH值7和40°C。氯化钠的浓度在中调整到0%,3%,6%,9%,12%和15% (w / v) 25°C和pH值7。增长评估间接通过测量浊度(OD 600海里)分光光度计(珀金埃尔默λ35 UV / Vis分光计,美国)48小时后的孵化。

应变SP54N生长在最佳培养条件BHSM补充3% (w / v)的生理盐水和2%的原油(v / v)为唯一碳和能源源25°C, pH值7和140 rpm轨道振动器(Heidolph Inkubator 1000加上Heidolph Unimax 1010年,德国)约为20天。文化进行了一式三份在250毫升厄伦美厄烧瓶内含有50毫升的媒介,而经济增长评估通过测量光密度在600海里。

核苷酸序列提交

原油的16 s rDNA基因序列oil-degrading细菌菌株SP54N提交NCBI-Gene银行下加入MG738221数量。

结果

隔离hydrocarbon-degrading细菌

24日原油降解菌株是奥兰港的海水与沉积物和隔离,通过富集培养和稀释亚文化与原油浓度增加(2%到10%,v / v)和净化板。降解实验表明,这些分离株表现出他们的变量增长率和原油的降解性BHSM介质与2%到10% (v / v)原油作为唯一的碳和能源源。中,应变SP54N拥有一个高增长率作为唯一碳和原油能源源,并支持高浓度的原油10% (v / v)。

染色鉴定SP54N

确定系统的关系应变SP54N和其它属的代表菌株之间Stenotrophomonas, about1500 pb 16 s rDNA基因的片段被放大了聚合酶链反应(图2)使用通用引物和只有932 pb测序(基因库ID: MG738221)。这个连续拉伸序列分析了爆炸中心在国家的工具生物技术信息(NCBI)网站使用创银行数据库。序列相似性的计算表明,偏应变SP54N 16 s rDNA基因序列的相似性得分高99%的菌株Stenotrophomonas maltophilia。随后,系统发育树构建使用类似的16 s rDNA序列(图3)。系统发育树进行使用Neighbor-Joining方法(18]。引导共识树推断从1000年复制(19]。分析涉及8个核苷酸序列,密码子职位包括1^圣+ 2^nd+ 3^{理查德·道金斯}和所有职位包含漏洞和缺失的数据被消除。

系统发育树表明,菌株SP54N有关物种Stenotrophomonas maltophilia(图4)。因此,应变SP54N被确认为Stenotrophomonas maltophilia。强调应变SP54N序列相似性和差异和最近的两个菌株PSM-5 (GQ267816.1)和PSM-2 (FJ906801.1)从基因库匹配,ClutalW多重序列比对(使用15所示),和结果图4。结果暴露在图3和4表明,应变SP54N有一些差异与相关菌株,它可能是一个新的物种的Stenotrophomonas maltophilia。

应变SP54N的殖民地是淡黄色,圆形,平滑,凸,整个利润率和1毫米直径2毫米孵化后25°C在营养琼脂板(24小时图5)。克应变表明,应变SP54N属于革兰氏阴性的杆状细菌(图5度)。的图5 b显示了殖民地的应变SP54N BHSM琼脂培养基有10%的原油(v / v)。应变SP54N的生化特性的结果进行了总结表1。

表1。SP54N菌株的形态学和生物化学特征。

不同的生物降解条件的影响

为了了解原油降解环境特征的分离菌株SP54N,环境退化影响因素进行调查,包括初始pH值、温度、和氯化钠浓度。

结果的影响不同pH值的增长率应变SP54N原油作为唯一的碳和能源源中表示图6。这条曲线所示,应变能增长酸度与最优增长率6 - 9 7。

影响不同的温度应变增长率SP54N原油作为唯一的碳和能源说明来源图6 b。结果表明,该菌株可以利用原油温度20°C到37°C,最大增长速率温度25°C。应变SP54N可以生长在温度低于20°C。

结果从不同浓度的氯化钠的作用速度增长的应变SP54N作为唯一的碳和原油能源源中表示图6 c。从曲线可以看出,最优浓度的氯化钠应变SP54N增长率最高的是3% (w / v)。然而,这种菌株可以容忍高盐浓度高达15% (w / v)。

烃降解隔离的生长动力学

细菌染色SP54N是这一研究获得的最优培养条件下培养,pH值7 3% (w / v)的氯化钠25°C,在BHSM中有2% (v / v)作为唯一的碳和原油能源源在20天。600纳米的光密度是衡量评估细菌生长,并显示了生成的结果图7。对数生长期的应变开始从第一天到13天,然后固定相是在第14天达到。

讨论

应变SP54N是hydrocarbon-degrading细菌属于之一Stenotrophomonas maltophilia,首先从海水和沉积物中分离出Oran-Algeria的港口,和有潜力开发方法来治理海洋环境污染石油碳氢化合物。

SP54N毒株的分子识别被认为是。因此,16 s rDNA基因的部分序列(932个基点)证实了识别Stenotrophomonas maltophilia物种有99%的相似度(图3和图4)。此外,应变SP54N的形态特征非常相似的菌株Stenotrophomonas maltophilia。应变SP54N的生化特性的结果总结表1。

研究培养条件对石油烃降解的影响是非常重要的,因为它可以提供关于微生物和它们的增长需求的信息,之前任何生物修复的贡献。揭示应变SP54N crude-oil-degrading条件,pH值从6到9,温度从20°C到40°C和氯化钠浓度从0%到15% (w / v)进行调查,如所示图6分别。

最大限度的增长获得了pH值7.0 (图6)。这个结果是在协议与通过Neethu et al ., (20.),邓小平et al。1)Kumari et al ., (21),显示的最大增长率Stenotrophomonas maltophilia炼油厂,隔绝污染土壤pH值7.5。根据Vandecasteele,极端的pH值抑制石油的生物降解22]。然而,在海洋环境淡水,优惠范围之间的pH值是7和8。

曲线的图6 b,我们注意隔离菌株生长在广泛的温度,从20°C到37°C(不到20°C)。这些结果显示同Rouf et al ., (23]。Rodriguez-Blanco和安东尼称,原油降解不妨做在4°C, 10°C和25°C控制条件在地中海的水24]。温度是最重要的因素影响的生物降解率直接影响细菌的新陈代谢(25]。

关于盐度,它可能有一个对烃降解能力产生积极影响。有几个碳氢化合物的矿化率与盐度之间的相关性(26]。然而,盐和油污染造成的问题清理使用生物修复,因为外部添加细菌不支持高盐度(27]。

在这项研究中,最适盐度测试结果表明,应变SP54N支持高浓度的氯化钠,生长在一个大范围的盐度(0%至15%,w / v),最大增长率为3% (w / v)的氯化钠(图6 c)。这些结果是一致的与获得的罗德et al .,显示Stenotrophomonas maltophilia增长率减少暴露在超过3% (w / v)的氯化钠(28]。

结果的动力学生长分离菌株对原油的(图7),在最优条件下,固定相在第14天达到。这些结果表明,该菌株有效地降解原油的能力。

几株Stenotrophomonas sp。以前报道的hydrocarbon-degrading能力(29日,30.]。其他Stenotrophomonas sp。株具有降解有机污染物的能力,如农药、杀虫剂,甲壳素,类固醇激素,和角蛋白(31日- - - - - -35]。此外,这物种拥有的能力解决烃污染环境(36,37]。

菌株的Stenotrophomonas maltophilia能够利用原油作为唯一的碳和能源源(38),多环芳烃(也许不久),如萘、芴、蒽(39,菲39,40],苯并[a]芘(41]。此外,Urszula, et al .,显示Stenotrophomonas maltophilia(应变KB2)能够降解高浓度的芳香族化合物,并且可能利用酚作为唯一的碳和能源的来源,不同的芳香族化合物如原儿茶酸(3 4-DBH) 4-hydroxybenzoic酸(4-HB)、安息香酸、香草酸和苯邻二酚42]。

Mahjoubi et al .,显示Stenotrophomonas maltophilia、孤立的从石油污染的沉积物和海水的炼油厂港比塞大海岸,北部的突尼斯,是最活跃的hydrocarbonoclatic孤立的应变与生物表面活性剂的重要生产和高乳化原油的活性(46%),并建议的结果Stenotrophomonas maltophilia可能构成潜在的候选生物修复,可能是有用的生物技术的应用程序(7]。这是证明了这一点物种有能力利用多种芳香基质作为唯一碳源,并可能降低80%的菲在48小时内比较,假单胞菌降解菲的70%在40天43,44]。此外,Stenotrophomonas maltophilia是一个非常强大的和有用的唯一的生物处理和废水净化7]。

分离株海水受污染的海洋沉积物和在我们的研究中承受重大的氯化钠浓度高达15% (w / v)和原油10% (v / v)的污染面积和感应机制开发感兴趣的酶这宽容可能反映出的进化适应。因此,应变SP54N可能是新的物种的Stenotrophomonas maltophilia。这种适应翻译在高稳定使细菌迅速回答更多的能力的新来源碳氢化合物然后细菌没有损坏(45- - - - - -48]。

结论

在目前的研究中,首先分离海洋石油hydrocarbon-degrading细菌菌株SP54N,海水和海洋沉积物的奥兰harbor-Algeria,被确认为Stenotrophomonas maltophilia根据其表型和系统发育特征,拥有一个出色的原油、增长能力和优秀的适应性在pH值和盐度,并可以作为一个好的降能器,建立一个环保,且经济有效的方法去除石油烃污染物在多样化的海洋环境污染的碳氢化合物和原油,尤其是在奥兰港。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

这项研究是由实验室(AquaBior),离开生物技术,奥兰大学1艾哈迈德·本·自然和生命科学学院,Oran-Ministry更高教育和科学研究(阿尔及利亚)。作者感谢科学群水产养殖和生物修复实验室(AquaBior)为他们的富有成效的帮助这项工作的发展。

资金

这项研究由实验室水产养殖和生物修复(AquaBior)和高的教育和科学研究、阿尔及利亚。

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