研究
，卷:15(2)DOI: 10.21767/0974-7532.1000151

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尼泊尔丁酸双孔马(Chiuri)的DNA条形码和序列注释研究

*通信:

Deepak Sharma和Janardan Lamichhane
生物技术系
加德满都大学理学院
尼泊尔
电话:+ 977 - 9851249996
电子邮件: (电子邮件保护)/(电子邮件保护)

摘要

丁酸双孔马。(Chiuri)，又称黄油树，是尼泊尔喜马拉雅药用植物，经济价值很高。利用DNA条形码分子遗传学方法对这些植物进行鉴定和研究，可以对该植物原料在中草药产品中的使用产生积极影响。内部转录间隔(ITS)基因位点被证明是这种植物最有效的DNA条形码来源。使用基本局部对齐搜索工具(BLAST)搜索GenBank和邻居连接(NJ)分析显示，它们之间的序列相似性非常接近(99.4%)物种的Diplokhema(美国国家研究中心生物技术来自其他国家的信息(NCBI)加入号MT497981。由于这种药用植物已被用作重要的草药成分，使用这种标记基因(ITS)可以使研究人员从甚至是高度降解的DNA样本或草药产品的掺假物中识别物质。这种物质的准确鉴定在草药制剂和生物活性添加剂的情况下尤其重要，包括未来对重金属或矿物质的研究。

关键字

DNA条形码;组学;大型X;掺杂物;草药产品

缩写

DNA:脱氧核糖核酸;ITS:内部转录间隔;BLAST:基本的本地对齐搜索工具;NJ:邻居连接;NCBI:国家中心生物技术信息;薄层色谱法;HPLC-UV:高效液相色谱-紫外;HPLC-MS:高效液相色谱质谱;PCR:聚合酶链反应;CTAB:十六烷基三甲基溴化铵;核糖核酸酶:核糖核酸酶

简介

落叶树Diplokhema butyracea spp. (Chiuri)属家庭山榄科。这种树一般高约20米，分布在尼泊尔各地，主要分布在喜马拉雅地区海拔400至1800米的开阔山坡上，以及尼泊尔北部、印度和不丹[1］．它也被称为尼泊尔黄油树，一种喜马拉雅药用植物。这种树的主要产品被称为Chiuri酥油，这是从种子中提取的酥油或脂肪。如今，由于蜂蜜的种植，它也成为一种重要的经济植物。2]以加强经济增长尼泊尔西部的农村发展。

该项目的总体目标是筛选具有经济意义的项目药用植物尼泊尔的[3.]，他们的生物勘探方法[4]，并使用DNA条形码及Mega X软件验证它们的身份及分类地位[5］．此处所述的黄油树将包括植物化学分析，生物活性和化学成分分析，如以前在其他类似植物中所研究的[6，7］．先前的研究报告了从印度收集的白蜡黄油的甘油三酯和脂肪酸组成[8，9]，但迄今为止还没有报道对来自尼泊尔的Chiuri植物进行分析的分子研究。因此，本研究旨在为DNA条形码和系统发育研究提供分子数据[10]对尼泊尔Chiuri植物的分布进行了研究生物信息学的方法。

传统的药用植物鉴定方法包括利用味觉、视觉、嗅觉、触觉等感官的感官方法，以及基于形状、颜色、质地鉴定的宏观和微观方法，以及薄层等化学剖面方法色谱法(TLC)、高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)和高效液相色谱-质谱光谱法(HPLC-MS)。然而，使用宏观和微观检查，没有一种方法可以轻易区分密切相关的物种。即使是基于化学剖面和标记的方法也可能受到生理变化和储存条件的影响。DNA水平的认证提供了更高的可靠性，因为它是一种稳定的大分子，存在于所有组织中，不受外界因素的影响。因此，开发基于dna的标记对药用植物的鉴定具有重要意义。

一种利用细胞核或细胞器基因组中的短DNA序列来识别生物标本的新技术被称为DNA条形码。2003年，圭尔夫大学的保罗·赫伯特(Paul Hebert)首次提出使用“DNA条形码”作为分类标识符[11］．在本研究中，我们发现从核糖体基因获得ITS基因的单株识别率最高(99.08%)，但由于从叶片和植物的其他部位(如Diplokhema butyracea spp)获得高质量的序列困难，其他人认为整体上更好的选择似乎是基于rbcL+matK序列的标准条形码。因为失败而放大在聚合酶链式反应(PCR)反应，我们选择使用ITS序列，因为这种扩增效果很好，使用基于距离的方法产生了接近90%的识别率[Taxon DNA [12］．然而，为了确定最佳的分析方法，可能需要更完整的标本取样。

方法

于2017年4月从帕尔帕县中部山区的自然栖息地随机采集样本。采集的标本来自Tansen至Ranighat地区森林的5个不同地点(图1)．这些样本由加德满都大学药学系的分类学家Tirtha Maiya Shrestha夫人鉴定。物种将材料提交到植物标本室，以获得后来用于NCBI序列提交的登录代码(KU_2017_CHRi 01)。

DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl Trimethyl铵，CTAB)法的一些改进，将采集到的叶片材料用于6个双裂叶样品的DNA提取和分析[13］．通过测量260 nm/290 nm的吸光度来计算DNA的回收率，单位为mg/gm。260 nm/280 nm吸光度比在1.8 ~ 2.0范围内，DNA收率在0.67 ~ 0.86 μg/ml范围内。这说明回收到的dna质量较高，含有非常高的含量低萜类化合物和多糖污染。CTAB法分离DNA时使用的化学物质通过去除所有杂质来提高DNA纯度。长期氯仿异戊醇处理去除叶绿素、色素和染料。使用核糖核酸酶(RNase)进行过夜处理以降解RNA。其他潜在污染物(洗涤剂、蛋白质、多糖等)通过苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1 v/v)和苯酚:氯仿(24:1)萃取(图2)．

PCR和测序

从所有植物样品中提取基因组DNA，用分光光度法定量分析，并用于聚合酶链反应所有3个基因位点按照iBOLD指南进行条形码。乐动KENO快乐彩用于扩增和测序cpITS2和cpITS3的引物是前面描述的cpit4区域的引物:5 ' ?G TATTCTGGTGTCCTAGGCGTAG ?3.′ and 5′?CGTAGCCACGTGCTCTAATCCTC?3′ were used.聚合酶链反应反应混合物含有10mm的Tris?HCl (pH 8.3)， 50 mM KCl, 2 mM MgCl2，每个dNTP 200 μM，每个引物0.4 μM, 0.5单位Taq聚合酶。反应在94°C 50 s, 58°C 40 s, 72°C 1 min的条件下进行30个循环。除ITS基因位点外，其余两个基因(matK和rbcL)均未通过QC扩增。因此，仅对ITS进行扩增，并进一步进行DNA测序分析，得到以下数据。

样品被送到了Eurofins基因组学在印度班加罗尔实验室用桑格法进行测序。基于Seq Scanner 2.0软件，利用NCBI的nBLAST工具和其他系统发育和序列分析专用软件对结果进行分析。

结果

爆炸输出

ITS区域及其反向和正向区域的Final序列如下(图3)．

ITS基因座Cotig 1前10个序列与BLAST输出的Mega X系统发育分析(图4)．

使用最大似然法和Tamura-nei模型推断祖先状态。该树显示了每个祖先节点上的一组可能的核苷酸(状态)，基于它们在位点1上的推断可能性。用该方法推导出初始树。站点之间的费率被视为站点之间的统一费率(统一费率选项)。该分析涉及10个核苷酸序列。最终数据集中共有1017个位置。进化分析在MEGA X中进行。

基于序列扫描软件的6个不同模块的序列组装和分析报告(图5-12)．

DNA条形码采用组学方法进行，系统发育树显示序列相似性，使用Clustal 2.0软件为(图13)．

丁酸双孔马。是尼泊尔的一种植物，从东部到西部海拔500米到2000米的地方广泛使用。社区居民将这种植物用于多种用途。树叶被用作牛和山羊的饲料，而长时间老化的原木被用于家庭家具。植物的主要部分是花和种子。花可用作蔬菜，成熟水果的果肉可用作日常生活中的黄油。由于每个水果的果肉含量高，以及大量的脂肪，黄油是一个很好的业务对于当地人来说，这种植物被认为是居住在尼泊尔山区的人们最好的创收作物之一。

通过Mega X软件对数据进行分析，采用自举值500的NJ似然法，发现了这一遗传变异物种所示图3而且4这清楚地表明物种多样性方面ITS基因位点只有潜在的条形码区域，可以将其作为一个真实的标记，甚至更多的其他条形码位点没有显示出直接的作用物种多样化可能是由于地质海拔变化或环境原因。

另一个图5-10显示了核苷酸的变异，这与物种的多样性有关。

由于其较高的经济价值，这种植物对研究也很重要，包括遗传鉴定，这可能有助于保护它作为该国的本土财产。利用我们的DNA条形码序列，现在人们可以对本地草药的来源进行更详细的研究，甚至可以对这类常用野生植物的保护和栽培进行更详细的研究。鉴定中草药配方中的掺假成分也可以通过条形码进行识别，并将提供更好的方法健康也要关心。基于数据库中生物序列的DNA条形码应针对所有有针对性和高价值的特异性进行开发药用植物物种。这可能是尼泊尔未来经济发展的最重要事件之一。

结论

丁酸双孔马。(Chiuri)是尼泊尔山区社区的主要植物之一，具有很高的经济价值。对该植物进行条形码编码，并将其序列存入在线数据库(登录号为MT497981)，将有助于该植物的鉴定和保护物种是尼泊尔主要的本土植物之一。研究发现这种珍贵植物的花、种子和果肉中存在的不同化学成分，以及它们的数量和生物活性、药用价值和食用价值是至关重要的，但尚未完成。我们建议将DNA条形码的使用集成到该地区植物区系研究和国家植物标本馆的工作流程中。这可以显著增加已识别标本的数量，并提高对物种在自然种群中的分布。ITS结合了最高的分辨能力，以区分密切相关物种带着兴奋聚合酶链反应测序成功率在很大范围内Diplokhema butyracea．我们的研究首先阐述了DNA条形码序列的这一点物种并将为分子生物学领域开辟新的途径生物技术对草药的研究医学及其在尼泊尔经济发展中的应用。

致谢

研究工作得到了尼泊尔大学资助委员会的财政支持和尼泊尔科学技术学院(NAST)尼泊尔的博士研究资助。我们也感谢Eurofins班加罗尔基因组实验室对DNA测序和数据分析的支持。我们也感谢Tirtha Maiya Shrestha对样品的分类鉴定。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

参考文献

1. https://ethnobiology.org/sites/default/files/pdfs/JoE/23-2/Sacherer2003.pdf。
2. 史瑞莎，潘迪，米什拉。蜂蜜价值链分析——以尼泊尔兰戎区加哈特村为例。中国生物医学工程学报，2017;4;107-112。
3. 张晓东，李志强，张志强，等。高原生物活性的筛选与测定药用植物尼泊尔。植物学报，2016;29:7。
4. 李志强，王志强，王志强，等。尼泊尔高海拔药用植物的民族药理学调查、植物化学筛选和抗菌活性测定:一种生物勘探方法。印度传统医学杂志2014;13:496-507。
5. 张晓东，王晓明，张晓明，等。MEGA X:分子进化遗传学分析跨越计算平台。分子生物学杂志，2018;35:1547-1549。
6. 王志强，王志强，王志强，等。三种不同的生物活性药用植物产于尼泊尔喜马拉雅地区。科学通报。2010;11:139-146。
7. 李志强，李志强，李志强，等。化学成分杜鹃lepidotum来自尼泊尔喜马拉雅山。化学学报。2014;50:767-769。
8. 李文杰，李志强，李志强，等。喜马拉雅地区药用植物资源的研究——蚕蛹种子脂肪的GC-MS分析(Diploknema butyracea)来自尼泊尔。杨晓明，2012;4:42-44。
9. Sengupta A, Choudhury SKR。甘油三酯组成Madhuca butyraceae种子脂肪。石油化工学报，2001;23(5):521 - 524。
10. 崔辰N，帕文I，潘Z，等。药用植物DNA条形码鉴定技术。《生物技术》2014;25:103-110。
11. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL，等。通过DNA条形码进行生物识别。中国生物医学工程学报，2003;
12. 陈晓峰，陈晓峰，陈晓峰，等蜡果杨梅esculanta(Kafal)，一种本土的多用途药用植物物种来自尼泊尔，作者rbcL和matK Gene。医药科学2020;4:11-18。
13. https://webpages.uncc.edu/ jweller2 /页面/ BINF8350f2011 / BINF8350_Readings / Doyle_plantDNAextractCTAB_1987.pdf。