原文
，卷:12(2)荧光光谱与同步荧光光谱对头孢他啶与胰蛋白酶反应机理的比较研究
- *通信:
- 宝生刘河北大学化学与环境科学学院河北省分析科学与技术重点实验室，河北保定071002电话:+ 86-312-5079385;电子邮件: (电子邮件保护)
收到日期:2017年6月23日接受日期:2017年7月22日发表日期:2017年7月28日
引用:刘波，王杰，边刚，等。头孢他啶与胰蛋白酶反应机理的荧光比较研究光谱学同步荧光光谱。化工学报，2017;12(2):116
摘要
采用荧光法研究了头孢他啶(CFD)与胰蛋白酶(TRP)的反应机理光谱学同步荧光光谱学结果表明，静电力对TRP与CFD的共轭反应起主要作用，猝灭类型为静态猝灭;用上述方法得到的结合常数具有相同的数量级，非常相似。静电力在CFD与TRP的相互作用中起关键作用，相互作用中结合位点的数量接近于1个。供体-受体距离r<7 nm，表明CFD对TRP的静态荧光猝灭也是一种非辐射猝灭能源转移的过程。两种方法检测结果一致，均为同步荧光光谱学可用于研究药物与蛋白质的反应机理，是对常规荧光猝灭方法的有益补充。
关键字
荧光光谱;同步荧光光谱;头孢他啶;胰蛋白酶;反应机理
简介
头孢他啶(Ceftazidime, CFD)是第三代头孢菌素，其结构、抑菌活性和稳定性均不稳定β-内酰胺酶已被广泛描述和研究(其结构如图所示)图1)．许多研究已经证明了它对好氧、厌氧革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的广谱抗菌活性。CFD适用于以下由敏感细菌引起的感染:下呼吸道感染、尿路感染、败血症、皮肤软组织感染，骨骼和关节感染也可以使用手术预防感染。
图1:CFD的化学结构。
胰蛋白酶(Trypsin, TRP)是一种丝氨酸蛋白酶，是自然界中含量最多的蛋白酶，在食物蛋白质的消化和解构以及止血、细胞凋亡、信号转导、生殖等生理过程中起着至关重要的作用免疫反应［1］．TRP的分子量为23,300道尔顿，由223个氨基酸残基组成[2］．单个链由六个二硫桥连接在一起。它由两个大小几乎相等的结构域组成，每个结构域的主要组成部分是一组由6个反平行的多肽链连接在一起形成一个β由h键组成的网络[3.］．TRP有四种氨基酸(Trp51、Trp141、Trp215和Trp237)，可用作本征荧光团[4］．由于其重要的生理功能，常被选为靶蛋白研究小分子对TRP的结构效应，从而研究其功能[5］．目前，TRP与许多配体之间的分子相互作用已被成功地研究生物化学域。然而，CFD与TRP之间的相互作用尚未被研究。本文利用荧光技术，研究了CFD与TRP在不同温度条件下的相互作用光谱学以及分子对接技术。利用Van't Hoff方程，得到了CFD与TRP反应的热力学参数。本研究有望提供重要的洞察实质，潜在的毒性之间药物并可为今后联合治疗提供有益的临床参考。
实验的程序
装置
所有荧光光谱均用岛津RF-5301PC荧光分光光度计记录。用UV-VIS记录分光光度计(UV-265，岛津，日本)测量吸收。所有pH值测量均使用pH - 3c精密酸度计(中国上海莱奇)进行。所有温度均由SYC-15B过热水浴池(南京桑力电子设备厂)控制。
材料
胰蛋白酶购自Sigma公司，纯度等级低于99%。头孢他啶(Ceftazidime, CAS#， 78439-06-2)来源于中国兽医监控器医学(纯度等级低劣99%)。股票TRP溶液(1.0 × 104M)和CFD (1.0 × 103M)准备好了。所有的股票进一步稀释溶液作为工作溶液。使用含0.15 M NaCl的Tris-HCl缓冲溶液将溶液pH维持在7.40，并使用NaCl溶液维持溶液的离子强度。所有其他试剂均为分析级，所有水溶液均用新双蒸馏水配制，并保存于277 K。
利用以下关系对激发光的吸收和发射光的再吸收进行了校正，以减少内部滤光片:
(1）
在那里,F天哪,FObs分别为校正后的荧光强度和观测到的荧光强度。一个前女友和一个em分别为CFD在激发波长和发射波长处的吸光度值。本研究中使用的荧光强度为校正后的强度。
程序
荧光测量:在典型的荧光测量中，1.0 mL Tris-HCl溶液，1.0 mL 1.0 × 105在10ml比色管中依次加入M TRP溶液和不同浓度的CFD。将样品加水稀释至成比例体积，摇晃充分混合，在不同温度(298、303和310 K)下静置30 min，激发和发射缝隙设置为5 nm。TRP的激发波长分别为280 nm和295 nm，胞径长度为10 nm。我们在340 nm处记录了荧光强度。
同步荧光测量:溶液制备如上所述。激发波长和发射波长Δλ分别设置为15 nm和60 nm。然后分别在300 nm和340 nm处记录了同步荧光强度。
常用的测量:Tris-HCl溶液0.5 mL, 1.0 × 10 1.0 mL5在10ml比色管中依次加入不同浓度的M TRP溶液和CFD溶液，参比溶液为相应浓度的CFD溶液。样品用水稀释至成比例的体积，摇晃充分混合，在298 K下静置30分钟。用1cm石英扫描有色氨酸和无色氨酸时的CFD紫外-可见吸收光谱细胞在190纳米到300纳米的范围内。
结果与讨论
紫外-可见吸收光谱研究
在CPD存在和不存在时TRP的紫外-可见吸收光谱如图所示图2．可以看出，TRP有两个吸收峰，分别在208 nm和280 nm处。随着CFD浓度的增加，图2结果表明，在208 nm处的吸收峰强度随红移而减小。结果表明，CFD与TRP的相互作用导致了新的配合物的形成，α-螺旋含量的改变导致了TRP构象的变化。280 nm处的吸收峰强度降低，说明CFD与TRP的相互作用发生在基态分子中。即CFD与TRP在基态下形成非发光配合物，导致TRP的UV-VIS吸收光谱发生变化。动态猝灭只影响荧光分子的激发态，不改变荧光物质的吸收光谱。由此可以初步推断TRP的CFD荧光猝灭类型为静态猝灭。
图2:TRP-CFD体系吸收光谱(T=298 K)， CTRP=2.0 × 105mol / L, 1 ~ 6: CCFD =(0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0, 30.0)×105mol / L。
TRP-CFD系统的荧光猝灭光谱
TRP-CFD体系的荧光光谱如图所示图3(类似于295纳米)。如图3当激发波长为280 nm时，随着CFD的加入，TRP的荧光强度有规律地下降，说明CFD对TRP的本征荧光有较强的猝灭作用，CFD与TRP之间存在相互作用。
图3:TRP-CFD系统的荧光发射光谱(T=298 K， λex=280 nm)。Ctrp =2.0 × 106mol / L, 1 ~ 10: CCFD =(0, 0.2, 0.4, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 10)×105mol / L。
为了清楚地了解荧光猝灭机理，采用Stern-Volmer方程(2)对荧光猝灭日期进行分析:
（2）
在那里,F0而且F分别表示不存在猝灭剂和存在猝灭剂时的稳态荧光强度。τ0为不存在猝灭剂的荧光寿命(τ0= 10-8 s)。Ksv为Stern-Volmer淬火常数。Kq为生物大分子的猝灭速率系数，[l为淬灭剂的浓度。的线性拟合图F0 / F与[l的值Ksv而且Kq能在不同的温度下得到吗表1．有人观察到Ksv随着温度的升高而下降，这就说明了复合物的形成。的值Kq远大于各种淬火剂的最大散射碰撞淬火常数(2 × 1010米－1·年代－1)，表明淬火过程为静态过程。这一结论与紫外-可见吸收光谱相一致。
| λ(nm)交货 | T/ (K) | Kq/ (L /摩尔·s) | Ksv/ (L /摩尔) | r1 | Ka /(L /摩尔) | n | r2 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 280 | 298 | 1.49 × 1012 | 1.49 × 104 | 0.9937 | 1.40 × 104 | 0.96 | 0.9976 |
| 303 | 1.36 × 1012 | 1.36 × 104 | 0.9932 | 1.35 × 104 | 0.91 | 0.9984 | |
| 310 | 1.20 × 1012 | 1.20 × 104 | 0.9986 | 1.24 × 104 | 1.01 | 0.9997 | |
| 295 | 298 | 1.11 × 1012 | 1.11 × 104 | 0.9991 | 1.14 × 104 | 1.02 | 0.9991 |
| 303 | 1.09 × 1012 | 1.09 × 104 | 0.9930 | 1.01 × 104 | 0.96 | 0.9929 | |
| 310 | 9.73 × 1011 | 9.73 × 103. | 0.9949 | 9.85 × 103. | 0.93 | 0.9936 |
Kq为淬火速率常数;Ka是结合常数;N为结合位点数;R1是的线性相对系数F0 / F∼[l];r2为log (F0−F)/F∼log{[Dt]-n[Bt](F0−F)/F0}的线性相对系数。
表1。TRP-CFD系统在不同温度下的淬火反应参数。
对于静态猝灭相互作用，当小分子独立结合到大分子上的一组等效位点时，结合常数(Ka)和结合位点数(n)可由式(3)得到:
（3）
(在哪里Dt]和[英国电信]分别为CFD和TRP的总浓度。卡而且n分别为fd - trp配合物的结合常数和结合位点数，分别由log[的回归曲线截距和斜率计算得到。(F0-F）/F]与log {(Dt) - (Bt) (F0-F) / F0}。如在表1的值。n均近似等于1，说明TRP中仅存在一个CFD结合位点。同时，结合常数Ka随温度升高而降低，基态配合物的稳定性随温度升高而降低，进一步表明猝灭是一个静态过程[6］．
主要结合位点研究
在280 nm波长，色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)残基被激发，而295 nm波长仅激发色氨酸残基[7］．基于Stern-Volmer方程，比较在280 nm和295 nm激发的蛋白质的荧光猝灭，可以估计Trp和Tyr基团在Trp - cfd系统中的参与。如在图4在CPMS存在的情况下，在280nm激发的BHb与295nm激发的BHb的猝灭曲线没有重叠，且280nm处的荧光猝灭程度大于295nm处的荧光猝灭程度。这一现象表明，Tyr和Trp残渣都参与了CFD与Trp的相互作用。
图4:TRP-CFD体系(T=298 K)在λex=280 nm和295 nm处的猝灭曲线。Ctrp =2.0 × 106mol / L, 1 ~ 10: CCFD =(0.2, 0.4, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 10)×105mol / L。
同步荧光光谱研究
当激发波长和发射波长之间的Δλ值稳定在15 nm或60 nm时，同步荧光分别给出酪氨酸或色氨酸残基的特征信息[8］．同步荧光最大发射波长的位置变化可以反映基团分子极性的变化。它可以在图5当Δλ=15 nm时，TRP-CFD的荧光强度明显降低，且不随CFD浓度的增加而变化。当Δλ=60 nm时，TRP-CFD的同步荧光强度随蓝移有规律地下降，说明CFD与TRP的相互作用改变了色氨酸的微环境，插入CFD后色氨酸残基微环境的变化降低了疏水环境的极性，增强了TRP腔内的疏水性。这导致了TRP的构象变化。当激发波长和发射波长之间的Δλ值稳定在15 nm或60 nm时，同步荧光强度降低，这进一步表明色氨酸和酪氨酸参与了TRP和CFD的相互作用。对于淬火过程，我们利用式(2)、(3)计算了系统的组合参数，计算结果列于表2．如在表2， Stern-Volmer猝灭常数Ksv随温度升高而降低，说明淬火过程为静态淬火。与此同时，价值观Kq均远大于各种淬火剂的最大散射碰撞淬火常数(2 × 1010米－1·年代－1)，证明淬火过程为静态淬火过程，并形成了新的配合物。结合叮咬数(n)约为1，说明一个CFD分子与一个TRP分子结合。Ka值随温度的升高而降低，说明基态配合物的稳定性随温度的升高而降低，也说明淬火过程为静态淬火过程。同步荧光法得到的猝灭机理与荧光猝灭法得到的猝灭机理一致。当激发波长为280 nm时，变化趋势相同。与此同时,比较表1和表2，可以看出两种方法TRP-CFD的淬火参数在同一数量级。
图5:TRP-CFD体系的荧光光谱(T=298 K) (A) Δλ=15 nm;(B) Δλ=60 nm。Ctrp =2.0 × 106mol / L, 1 ~ 10: CCFD =(0, 0.2, 0.4, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 10)×105mol / L。
| Δλ(nm) | T/ (K) | Kq/ (L /摩尔·s) | Ksv/ (L /摩尔) | r1 | Ka /(L /摩尔) | n | r2 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 15 | 298 | 1.61 × 1012 | 1.61 × 104 | 0.9953 | 1.69 × 104 | 0.98 | 0.9972 |
| 303 | 1.59 × 1012 | 1.59 × 104 | 0.9997 | 1.67 × 104 | 0.93 | 0.9993 | |
| 310 | 1.56 × 1012 | 1.56 × 104 | 0.9936 | 1.58 × 104 | 0.91 | 0.9968 | |
| 60 | 298 | 1.12 × 1012 | 1.12 × 104 | 0.9983 | 1.14 × 104 | 1.03 | 0.9986 |
| 303 | 1.06 × 1012 | 1.06 × 104 | 0.9986 | 1.08 × 104 | 0.95 | 0.9994 | |
| 310 | 8.62 × 1011 | 8.62 × 103. | 0.9956 | 9.93 × 103. | 0.91 | 0.9970 |
Kq为淬火速率常数;Ka是结合常数;N为结合位点数;R1是的线性相对系数F0 / F∼[l];r2为log (F0−F)/F∼log{[Dt]-n[Bt](F0−F)/F0}的线性相对系数。
表2。TRP-CFD系统在不同温度下的淬火反应参数
TRP-CFD系统相互作用力类型
通过CFD与TRP反应的热力学参数，可以得到TRP-CFD体系相互作用力的类型。如果温度变化不大，则将ΔH的值视为常数。根据TRPCFD体系在不同温度下的Ka值表1和表2时，热力学参数可由式(4)和式(5)计算:
（4）
（5）
结果显示在表3．ΔG的负值明确了TRP与CFD之间的自发反应。ΔH的负值和ΔS的正值说明CFD主要通过静电吸引与TRP结合[9］．如在表3，同步荧光法与荧光猝灭法得出的结论一致，表明同步荧光法可以取代荧光猝灭法来确定TRP-CFD系统相互作用力的类型。
| 变量 | T/ (K) | 卡/ (L·摩尔－1） | ΔH/ (KJ·摩尔－1） | Δ年代/ (J·摩尔－1·k - 1) | ΔG/ (KJ·摩尔－1） |
|---|---|---|---|---|---|
| λ的前女友= 280海里 | 298 | 1.40 × 104 | -8.08 | 52.22 | -23.64 |
| 303 | 1.35 × 104 | 52.38 | -23.95 | ||
| 310 | 1.24 × 104 | 52.23 | -24.27 | ||
| λ的前女友= 295海里 | 298 | 1.14 × 104 | -8.96 | 47.55 | -23.13 |
| 303 | 1.01 × 104 | 47.10 | -23.23 | ||
| 310 | 9.85 × 103. | 47.50 | -23.69 | ||
| Δλ= 15海里 | 298 | 1.69 × 104 | -4.41 | 66.11 | -24.11 |
| 303 | 1.67 × 104 | 66.28 | -24.49 | ||
| 310 | 1.58 × 104 | 66.13 | -24.91 | ||
| Δλ= 60海里 | 298 | 1.14 × 104 | -8.84 | 47.97 | -23.14 |
| 303 | 1.08 × 104 | 48.04 | -23.39 | ||
| 310 | 9.93 × 103. | 47.97 | -23.71 |
表3。TRP-CFD系统在不同温度下的热力学参数。
TRP-CFD系统的希尔系数
根据TRP-CFD系统的希尔系数，我们可以根据以下公式对蛋白质与配体的协同结合进行定量分析[10]：
(6）
其中Ka是结合常数，Y是分数结合饱和度，nH是希尔系数。希尔系数大于1，表现出积极的协同作用，且作用随着增大而增强nH．反之，当希尔系数小于1时，表现出负协同性，其作用随着减小而增强nH．系数为1表示非合作反应。
用于荧光测量:
(7）
（8）
在1 /Qm为1/Q与1/[的截距l］．根据式(6)，TRP-CFD系统的Hill系数可由log[Y/(1−Y)]对log[的曲线斜率得到。l］．结果在表4．我们可以看到nH同步荧光法和荧光猝灭法在不同温度下均近似等于1，表明TRP与CFD之间存在非合作反应。同时，说明同步荧光法可以取代荧光猝灭法测定CFD与TRP的协同结合。
| T/ (K) | λEx = 280 nm | λEx = 295 nm | Δλ= 15海里 | Δλ= 60海里 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| nH | r5 | nH | r5 | nH | r5 | nH | r5 | |
| 293 | 0.89 | 0.9969 | 0.936 | 0.9981 | 0.883 | 0.9988 | 0.949 | 0.9970 |
| 303 | 0.91 | 0.9905 | 0.918 | 0.9997 | 0.843 | 0.9963 | 0.914 | 0.9973 |
| 310 | 0.87 | 0.9908 | 0.874 | 0.9915 | 0.861 | 0.9944 | 0.86 | 0.9921 |
表4。TRP-CFD系统在不同温度下的希尔系数。
TRP与CFD的绑定距离
根据Förster的无辐射能源转移理论，供体和受体之间的距离(r)是关键能源传输距离R0时，能量传递效率为50%，则能量传递效率E可由公式计算:
（9)
（10）
（11）
在哪里F0为供体的荧光强度，F是存在相同浓度受体时供体的荧光强度，K2是方向因子，Φ为没有受体时供体的荧光量子产率，N为介质折射率，F (λ)为荧光供体在波长处的荧光强度λ而且ε(λ)是该波长下受体的摩尔吸收系数。在这些实验条件下，据报道K2=2/3, N =1.336和Φ= 0.118 (11］．J为供体荧光发射光谱与受体吸收光谱的重叠积分。因此J，E，R0和r的计算和表示表5．如在表5，当供体-受体距离r<7 nm时，表明供体-受体距离r<7 nm能源从TRP向CFD转移的可能性较大。距离r增加能源随着温度的升高，效率E降低，导致二元体系稳定性降低，Ka值降低。此外，本研究中r值大于R0，说明CFD可以通过静态猝灭机制对TRP的本征荧光进行强猝灭[12］．此外，从表5，采用同步荧光法获得的数据光谱法(Δλ=60 nm)与荧光猝灭法基本一致，所得结论也一致。因此，我们可以利用同步荧光(Δλ=60 nm)计算TRP-CFD系统的联合距离(图6)．
图6:CFD的紫外吸收光谱(1)和荧光发射光谱(2)以及同步荧光光谱(Δλ=60 nm) (3) (T=298K);Ccfd = ctrl =2.0 × 106mol / L。
| 系统 | λ的前女友= 280 nm | Δλ= 60海里 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| T/ K | E（％） | J/(厘米3.·L·摩尔－1） | R0 /纳米 | r/纳米 | E（％） | J/(厘米3.·L·摩尔－1） | R0 /纳米 | r/纳米 |
| 298 | 2.96 | 7.76 × 10-16年 | 1.60 | 2.86 | 3.62 | 7.58 × 10-16年 | 1.59 | 2.76 |
| 310 | 1.92 | 7.02 × 10-16年 | 1.57 | 3.03 | 2.83 | 6.88 × 10-16年 | 1.56 | 2.83 |
| 318 | 1.58 | 6.45 × 10-16年 | 1.55 | 3.09 | 2.17 | 5.72 × 10-16年 | 1.52 | 2.87 |
表5所示。TRP-CFD系统在不同温度下的绑定参数。
结论
本文研究了CFD与TRP的相互作用机理，并将传统的荧光猝灭法与同步荧光光谱法进行了比较。结果表明，两种方法的数据在同一数量级上，且非常接近。此外，猝灭机制和相互作用力类型一致，表明荧光是同步的光谱法可以研究配体与蛋白质的结合机制，是对常规方法的有益补充。同步荧光具有选择性好、灵敏度高、光谱简化、波段变窄、干扰小等优点，在研究配体与蛋白质的反应机理方面比常规荧光猝灭更有用。
确认
本文作者在此感谢中国国家科学基金资助项目(no.;20675024)和河北大学2016年实验室开放项目(批准号:20675024);sy201658)。
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