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山茶花青素还原酶基因(CaLAR)的克隆与表达研究

*通信:

Afruza扎曼印度阿萨姆邦Jorhat-785008茶叶研究协会托克莱茶叶研究所生物技术部
电话:+0376 236 0972;电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

亮色花青素还原酶(leuco花青素reductase, LAR)是植物类黄酮途径的下游酶之一。已知该基因与儿茶素积累呈正相关，儿茶素是一种类黄酮化合物。本研究旨在从一个山茶品种中分离出LAR基因，并通过定量实时聚合酶链式反应研究其在茎尖和根中的表达规律。qRT-PCR分析表明，根系中LAR的表达量比茎尖增加了0.6倍。将该基因全长cDNA克隆到异源宿主大肠杆菌(Escherichia coli)，并进行蛋白表达研究。表达蛋白分子量约为50 kD。LAR基因在儿茶素积累中的作用有待进一步研究基因表达儿茶素浓度。

关键字

山茶花assamica;克隆;大肠杆菌;Leucoanthocyanidin还原酶;茶

简介

黄酮类化合物是植物中产生的次生代谢产物。近年来，由于其具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肥胖和抗癌等显著的健康益处，它们的重要性越来越高[1，2］．茶叶是最重要的经济作物之一类黄酮为啤酒的爽口和涩味负责。茶的类黄酮含量是咖啡的750倍，其中儿茶素类黄酮含量最高[3.，4］．茶类黄酮生物合成途径涉及多种酶的相互作用，产生儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素和没食子儿茶素[5］．

LAR是参与原花青素生物合成的关键酶之一，催化单体亚单位儿茶素的产生[6］．它是类黄酮生物合成途径的下游基因之一，可能对儿茶素的积累有直接影响。报告显示，LAR基因的表达与茶叶中总儿茶素的积累呈正相关(茶树) [5］．LAR基因首次从山蚂蝗属钩骨由坦纳等．［7］．后来，该基因也从几种植物中分离出来物种特征是[6，8］．坦纳等．结果表明，LAR蛋白能够催化花青素、花青素和花青素转化为相应的反式黄烷-3-醇[7］．LAR基因已被证明具有不同的表达模式皮肤葡萄藤的种子(葡萄) [9］．这可能表明在同一种植物的不同器官中儿茶素的积累模式不同。

考虑到LAR之间的正相关基因表达和儿茶素积累，研究了在阿萨姆茶不同器官(茎尖和根)中LAR基因表达模式的差异(山茶花assamica)．然后克隆该基因的全长cDNA，并在细菌表达系统中表达，以研究LAR蛋白。

材料与方法

植物材料

茎尖(两片叶子和芽)和根采集自S.3A/3茶树，保存在阿萨姆邦Jorhat的Tocklai茶叶研究所种质资源收集中心。S.3A/3是阿萨姆茶的代表(山茶花assamica)．收集的样品立即保存在-80°C，以防止由于酶活性而导致样品质量的任何损失。

RNA提取和cDNA合成

总RNA提取从每个样品100毫克根据协议的扎曼等．［10］．在1%琼脂糖凝胶上检测提取RNA的完整性和质量。用生物光度计(Eppendorf)记录RNA的浓度和纯度。

从每个样本中提取1000 ng RNA，使用Verso cDNA合成试剂盒(赛默飞世尔科学公司)制备第一链cDNA。该cDNA随后用特定引物扩增基因表达研究和克隆目的。

茶树不同组织的基因表达研究

基因序列茶树在NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行底漆设计。使用Primer 3 (v.0.4.0)软件设计基因特异性引物，生成150 bp至200 bp范围内的产物(补充表1)．通过定量RT-PCR检测茶树茎部和根部LAR基因的表达。以茎尖和根的cDNA为模板进行研究基因表达模式。定量RT-PCR在Light Cycler 480系统(Roche)中进行。聚合酶链反应在10 μl的反应体积中，加入1X SYBR Green master mix (Thermo Fisher Scientific Inc.)，每个引物0.5 mM, 0.5 μl cDNA模板和无核酸酶水调节反应体积。所有的反应都进行了三次。

补充表1。研究中使用的不同引物的序列。

分析基因表达采用ddCt法。以18S rRNA基因为内参基因，将LAR基因的Ct值归一化。折叠变化基因表达相对于射击样品计算。

基因全长扩增及测序

用于全长基因扩增的引物设计为包含一个适配器序列，该适配器序列是该载体同源区域的反向补体。随后是核糖体结合位点(RBS)和基因特异性序列，用于连接到感兴趣的载体。(图1引物序列已在补充表1)．

从茎尖制备的cDNA使用全长基因特异性引物进行扩增，预期条带大小为1098 bp。聚合酶链反应以0.5 μl cDNA模板、1X Taq buffer B、1.25 mM MgCl为原料，在10 μl体积下制备反应混合物₂，正向和反向引物各0.5 mM, 0.03 U Taq DNA聚合酶。反应在Veriti 96孔热循环器(应用生物系统公司)中进行，其剖面如下(表1)．

表1。聚合酶链反应全长基因扩增剖面图。

扩增后，将扩增产物在1%琼脂糖凝胶上100 V电泳30分钟。使用Hipura Quick凝胶纯化试剂盒(Himedia)对所需扩增子进行凝胶纯化。通过ABI 3130xl遗传分析仪(Applied Biosystems)的毛细管测序对纯化的扩增子进行测序，以确认分离基因的身份。

载体扩增和克隆

从德国ATG生物合成公司购买的pACE1载体用于LAR基因的克隆和表达。pACE1载体用载体特异性引物(supplementary表1)，根据制造商的说明，生成矢量(图1)．在100 μl的反应体积中进行载体扩增，反应体积包括100 ng模板DNA(载体DNA)、1 mM正向和反向引物、2倍HF缓冲液和0.01 U Phusion DNA聚合酶(NEB)。在扩增过程中保持以下剖面(表2)．

表2。聚合酶链反应矢量放大剖面。

在1%琼脂糖凝胶上检查放大的线性化矢量，以确认预期的条带大小为2529 bp。

郑教授报道的序列和连接独立克隆(SLIC)方法等．［11]，将LAR基因克隆到载体中。该方法依赖于T4 DNA聚合酶的5 '外切酶活性，在没有dNTPs的情况下产生3 '悬垂(图1)．线性化的载体pACE1和扩增的LAR基因在NEBuffer 2和T4 DNA聚合酶存在下以1:1的摩尔比混合，并在室温下孵育3分钟。然后将反应混合物立即转移到冰中并放置10分钟。用该混合物转化50 μl具有化学活性的DH10β细胞采用热冲击法。转换后的细胞在含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板表面划纹，作为选择标记，37℃孵育过夜。

蛋白质表达研究

利用菌落对出现在选择板上的菌落进行筛选，以确定是否存在含有感兴趣基因的重组载体聚合酶链反应限制消化。利用阳性克隆进一步分离重组质粒，将其转化为具有化学活性的BL21 (DE3) pLyss细胞(内)。用1 mM异丙基β-D硫半乳糖吡喃苷(IPTG)诱导蛋白表达，用Qproteome细菌蛋白制备试剂盒(Qiagen)提取蛋白。将提取的蛋白样品装入SDS-PAGE凝胶中分析重组蛋白的存在[12］．

结果

LAR基因在芽、根中的表达分析

从茎尖和根部提取的总RNA质量良好，显示存在完整的28S和18S核糖体RNA条带(图2)．理想的A260/280比值为1.8也证实了提取RNA的质量。从每个样本中提取1000 ng RNA合成第一条cDNA，随后将其作为扩增LAR基因的模板。

利用RT引物扩增了部分LAR基因，并在山茶幼苗和根中进行了扩增。约150 bp的大小证实了该基因的准确扩增。然后通过qRT-PCR研究LAR基因在两种植物部位的表达模式，以了解儿茶素在不同器官中可能的积累。对两种样品中扩增基因的分析表明，在根部样品中LAR基因的表达量比茎尖样品高0.6倍。在相同的环境条件下，LAR基因的表达增加可能是由于该基因在根中的拷贝数高于在茎尖中的拷贝数。

LAR基因序列确认

使用基因特异性引物对LAR基因进行全长扩增，条带大小为1098 bp (图3)．扩增的基因测序，然后进行多序列比对(MSA)使用ClustalW的LAR基因序列模板进行编程c . sinensis引物就是从它设计出来的。MSA与模板序列的相似性超过99%，证实了分离到的LAR基因的身份c . assamica．

巷1:茎尖LAR基因扩增

Lane 2:根系LAR基因扩增

第三行:1kb分子梯(NEB)。

LAR基因的克隆与表达研究

利用基因特异性引物成功扩增了一个完整的LAR基因，并采用SLIC方法克隆到pACE1载体上。这一点在殖民地上很明显聚合酶链反应结果显示，LAR基因片段在离体菌落中扩增(图4)．

1巷:500bp分子梯(Genei)

Lane 2-6: 5个不同菌落的LAR基因扩增

使用HindIII和BamHI限制性内切酶进行限制性内切作图，释放1098 bp的插入片段和2529 bp的载体主干(图5)．

在确认LAR基因已整合到载体中后，将重组载体重新转化到BL21 (DE3) pLyss表达体系中，用于重组蛋白的生产。1 mM IPTG诱导重组蛋白表达。从培养物中提取总蛋白并加载到sds -聚丙烯酰胺凝胶上。经凝胶染色和去染色后，诱导的重组蛋白可见为一条暗带(图6)．蛋白带大小约为50 kD。

Lane T: 1 mM IPTG诱导的LAR蛋白

Lane M:蛋白质分子标记(Thermo Scientific)。

讨论

茶树是儿茶素最丰富的来源之一，已经进行了与儿茶素生产改进有关的各种研究。儿茶素生产的途径涉及许多酶的通讯，其中下游酶亮色花青素还原酶(LAR)起着重要作用。已知该基因参与了将白色素直接转化为儿茶素的过程。CaLAR基因是从一个麻花品种S.3A/3中分离得到，经测序鉴定。CaLAR的ORF为1029 bp，与Lei报道的LAR序列大小相同等．［13］．经1 mM IPTG诱导后，通过SDS-PAGE分析确认LAR蛋白。这种诱导蛋白的大小接近50 kD，表明不同的翻译后修饰可能增加了蛋白质的大小，而理论大小为37.5 kD。相比之下，雷等．［13]在早期的一项研究中报道了这种蛋白质的大小为60kd。LAR基因在异源宿主中的成功表达需要与儿茶素的产生量进行比较。这将通过操纵LAR基因的表达来实现儿茶素的高效生产。

已知LAR基因对儿茶素总积累有积极影响。关于该基因的表达模式与儿茶素总积累的关系已有许多研究[6，14］．在温主持的一项研究中等．在UV-C照射对黄烷醇积累的影响方面，发现UV-C照射增加了LAR基因的合成和活性，从而增加了葡萄果实中黄烷醇的积累[15］．刘等．早前曾报道过拟南芥ldox过度表达可可LAR基因的突变体显示儿茶素和表儿茶素水平升高[16］．在此背景下，我们研究了LAR基因在山茶品种S.3A/3茎尖和根中的表达模式。real - time - PCR检测结果表明，LAR基因在根中优先表达，在茎尖中优先表达。杨树根系中LAR基因的过表达(Populas trichocarpa)的报道等．［17]，该基因的构成性表达将能够促进增强对真菌病原体。在茶里(茶树)，表明LAR基因在儿茶素积累中的作用在体外彭浩翔清楚地分析了等．［18］．后,刘等．在春收茶树中LAR基因的相对表达量(C.sinensis)与儿茶素总积累的增加呈显著正相关[19］．在阿萨姆型茶树的根中，LAR基因的组织特异性和表达增加，因此，从早期的报道中可以看出，这可能是儿茶素在根中积累增加的一个迹象。话虽如此，儿茶素在嫩枝和根中的浓度还需要进一步研究，以确定LAR的直接相关性基因表达随着儿茶素的积累。

结论

全面了解类黄酮途径酶的活性将有助于我们设计提高儿茶素产量的途径基因。LAR基因是该途径的重要下游基因，此前已被证明对儿茶素的积累有积极影响。LAR基因在根中的表达量增加山茶花assamica与茶树的茎尖相比。这可能表明根中儿茶素含量较高，需要进一步评估。成功克隆全长LAR基因并在细菌宿主中表达，将为将来以商业目的生产儿茶素创造机会。

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