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生物降解的鸡毛培养产碱杆菌属和Brevundimonas

*通信:

Quezada-Cruz米、部门Quimico-Biologicas大学Tecnologica de Tecamac。37.5公里。Carretera联邦墨西哥——帕丘卡。上校塞拉赫莫萨。CP 55740。Tecamac,江户。墨西哥,电话:+ 52 55 5938 8400,电子邮件: (电子邮件保护)

文摘

使用最广泛的流程的降解羽毛用纯的菌株。本研究的目的是为了规范鸡毛的生物降解的最佳实验条件。共培养的研究是在一升的玻璃瓶进行细菌分离和鉴定的16 s rDNA测序粪产碱杆菌属和Brevundimonas diminuta鸡加工厂。最好的结果在第一阶段(温度和碳源)通知第二阶段,由羽毛的退化的评估使用不同浓度的营养肉汤(25%、50%和100%)。蛋白质和氨基酸的浓度是量化评估的降解羽毛。结果表明,该方法可以实现总降解羽毛(包括脊柱)与营养肉汤11天。最大浓度的可溶性蛋白质降解过程后获得的分数在32°C和营养肉汤为25%,50%和100%,12.60±0.1μgμg /毫升/毫升,14.60μg /毫升和18.60±0.02μg /毫升μg /毫升±0.01μg / mL,分别。自由氨基酸的生产2.64毫克/毫升,发现色氨酸和酪氨酸。这项研究显示了一个有前途的生物技术减少污染的羽毛。

关键字

粪产碱杆菌属;Brebundimonas diminuta;生物降解;羽毛;经济增长动力

介绍

世界上大量的鸡毛生成,这些被认为是浪费(1]。这些羽毛进行主要来自鸡加工厂和家禽养殖场;他们代表污染的重要来源,因为5至10%的总重量鸡的羽毛(2]。

第一个方法减少鸡毛所产生的污染的影响是将它们添加到动物饲料添加剂,因为干重的95%是蛋白质,其中88%是角蛋白(3]。然而,二硫桥,氢键和疏水角蛋白的相互作用使其不溶性,很难消化4]。几项研究已经试图增加其溶解度,将它置于一个过程与高压力和温度;然而,这个过程有严重缺点,包括其高成本和破坏等不耐热的氨基酸组氨酸,蛋氨酸和色氨酸5]。

Kornillowicz-Kowalska提到这些问题导致了一个激进的改变方法处理羽毛。近年来新方法研究涉及的生物降解羽毛发酵使用微生物或酶;这些过程是经济的,也使新产品的开发5]。最近的研究评估了退化的羽毛微生物如下列细菌属:芽孢杆菌(6- - - - - -12),Chryseobacterium(13),Kocuria(3,4,14),、黄(15,16),假单胞菌(2,17,18),明串珠菌属(2),Scopulariopsis(19),Stenotrophomonas(20.),Fervidobacterium(21];放线菌等Actinomadura(22];真菌等Coprinopsis和曲霉属真菌(23,24),财团的细菌(25和财团de放线菌26]。此外,一些作者基因修改的大肠杆菌,Brevibacillussp.和枯草芽孢杆菌为了加快鸡毛的退化(27- - - - - -29日]。给定的难度保持纯洁和转基因菌株在无菌条件下使用鸡毛等复杂基质,越来越多的研究集中在退化的鸡毛使用微生物财团和共培养,可以大规模生产,与纯文化相比,不经常在经济上可行的高成本维护、基质、杀菌、生物量和恢复等因素(30.]。因为微生物财团和共培养的重要性在鸡毛的退化,这是有用的识别微生物使用分子工具,而这些文化的重要组成部分[31日]。技术用于Yusuf et al。32]因为羽毛的识别孤立的文化包括16 s rDNA序列的分析辅以菌株的形态学研究。其中最重要的微生物确定的形态和过去的鸡毛退化的过程中,我们可以提地衣芽孢杆菌、链霉菌属sp.和产碱杆菌属sp。32,33]。

在墨西哥,很少有研究家禽的退化浪费使用微生物财团或培养。我们的这些分离的菌株工作组微生物从鸡加工厂Las玫瑰花,位于Tizayuca,墨西哥伊达尔戈。这些菌株后来被组合起来形成一个培养的过程以提高生物的鸡毛。

本研究的目的是为了规范鸡毛的生物降解的最佳实验条件。

材料和方法

羽毛的组成

羽毛的近似分析了使用数字水分分析仪来确定水分(MB45 OHAUS9),蛋白质含量使用微Kheldahl装置(采用AOAC公认47021)醚使用索氏提取器(采用AOAC公认的920.39摄氏度),灰使用Kleem方法(采用AOAC公认的14.006)和纤维含量使用温迪方法(采用AOAC公认的7.064)(34]。

羽毛降解

羽毛的准备:羽毛是用自来水洗净,并允许晾干24小时60°C。5克重,洗2次煮5分钟之前被放在烧瓶。

这项研究是在一升的玻璃瓶进行有效容积为500毫升。5.3×10的混合物⁵±0.1×10⁵1和5.0×10 CFU的压力⁵±0.25×10⁵菌落菌株2之前生长在营养肉汤被添加到烧瓶。文化条件是:搅拌在120 rpm和pH值6.8 - -7.2为14天。在第一阶段,一个实验设计3²被用来评估以下因素:温度(25°C, 32°C和37°C)和碳源(乳清,营养肉汤和Luria-Bertani汤)。在第二阶段中,降解羽毛的评估与不同浓度的营养肉汤(25%、50%和100%),同样的条件,第一阶段。

的降解羽毛和细菌的生长进行评估通过测量吸光度在620 nm根据先前的报道4,35]。

氨基酸和蛋白质浓度

样本退化过程后,透过绘画纸玻璃纤维纸(GF /纸,22毫米直径)量化可溶性蛋白质的浓度的分数决定的方法(36];建立校准曲线,我们使用牛白蛋白(SPINREACT s.a. / S.A.U.);氨基酸的浓度是由ninhidrin方法(37]。芳香族氨基酸被发现在280 nm紫外线分光光度法标准酪氨酸(Sigma-Aldrich、日本)和色氨酸(默克公司、德国)。

微生物的分子识别

基因组DNA的提取采用CTAB法执行的(38]。16 s rDNA的放大是执行2400年优秀thermocycler使用以下通用引物:FD1 (5 ' -agagtttgatcctggctcag-3 ')和一国(5“-acggttaccttgttacgactt-3”) (39]。的聚合酶链反应进行初始变性5分钟的95°C,和每个周期95°C的变性30年代,30年代的对齐的48°C, 90年代72°C的一个扩展,和最后一个扩展72°C的8分钟,共有35周期(39]。的聚合酶链反应产品被Macrogen韩测序;他们被描述为16 s rDNA的部分序列。物种爆炸对齐进行确定。

扫描电子显微镜

样品的结构(球形和椭圆)中形成的退化脊柱的羽毛被固定在戊二醛(3.0%)在磷酸盐缓冲剂(0.1 M;pH值7.2)在室温下24 h。他们用去离子水冲洗2次,可以站在去离子水40分钟。Post-fixation在锇酸(1%)进行了一个小时,然后样本冲洗磷酸盐缓冲剂。post-fixation后,样品在一系列在不同浓度醇脱水,干一个临界点。然后他们被涂上一层薄薄的使用Jeol gold-palladium 60秒钟,jfc - 1100好外套离子溅射。样品在扫描电子显微镜观察JEOL地产6390 5,000和000 x。

统计分析

研究的影响因素(温度和碳源)的降解羽毛由方差分析分析决定使用一款统计软件统计软件(α)显著性水平为0.05。

结果与讨论

羽毛的化学成分

的表1显示了鸡毛的构成。羽毛是构成蛋白质的主要(89%),纤维(8%)、脂肪(2%),和更少的比例由无机物(0.6%)(40]。报道称,蛋白质含量大约是76%,角蛋白的总含量是72%。另一方面,在文学报道,羽毛是由蛋白质(90% - -95%)和脂质(5% - -10%)10,41类似的结果在我们的研究。

表1:构成鸡毛。

羽毛降解

图1一个,b和c显示的结果降解羽毛;在所有情况下,吸光度随细菌的增长,表明降解羽毛,越好生物质增长是在32°C使用3个碳源(营养肉汤,乳清和Luria-Bertani),获得的最大吸光度是5.1,12.23,6.2 - 14日分别为7和14天。吸光度与鸡毛的退化。总羽毛降解是观察到11和14天分别用营养肉汤和Luria-Bertani。查图尔维迪et al。18)进行了一项研究在相似条件下的降解羽毛。他们把5克的羽毛在30°C, 250毫升瓶与pH值7.5和125 rpm。他们观察到增加的增长细胞在退化的羽毛。

因素方差分析分析表明,在研究了重大鸡毛的退化。的平均吸光度温度为4.60,7.06和4.08在25°C,分别为32°C和37°C (图2)。的平均吸光度碳源为5.82,4.91和4.87乳清,分别营养肉汤和Luria-Bertani汤(图3)。吸光度是观察到最高32°C,使用乳清作为碳源。然而,高吸光度只是由于细菌的增长,当食用乳清而不是退化的羽毛,视觉上的羽毛在这个实验完成。二附中显示结果在同一温度和吸光度与营养肉汤的总降解羽毛被观察到。因此,第二阶段的研究进行了营养肉汤在32°C。在所有的实验中使用一个控制(蒸馏水+培养+羽毛)显示一个直系增长(吸光度:0.8±0.2)。因为这是重要的额外使用碳源。

一些作者已经观察到,没有羽毛,碳源,芽孢杆菌megaterium生产几乎没有keratinolytic酶。羽毛的存在大大增加相比,这种酶的生产中没有羽毛。此外,它已被观察到的羽毛和一些碳源(葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、等)引起的高生产keratinolytic酶(9]。

氨基酸和蛋白质浓度

在研究的第二部分(与营养肉汤32°C),三种不同浓度的营养肉汤被用来确定其影响降解的羽毛。结果表明,可溶性蛋白的浓度(图4)的浓度增加而增加营养肉汤(25%、50%和100%)12.60±0.1,14.60±0.02,18.60±0.01μg / mL,分别。最高浓度的可溶性蛋白(18.6μg /毫升)获得100%用营养肉汤发酵共培养的过程,这促进了经济增长。这些结果与通过宋et al。15),使用不同的碳源(葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉等)Stenotrophomonas maltophilia降解羽毛和获得可溶性蛋白的浓度为13.8±0.7 - -19.7±2.6μg / mL,最小和最大浓度分别获得了乳糖和可溶性淀粉。他们观察到的最大活动keratinolytic酶(29.5±0.5 U /毫升)的最大值细胞生长和可溶性蛋白的浓度是通过添加葡萄糖为2%。Grazziotin et al。42)也报告更高程度的角蛋白水解和增加的比例更小、更可溶角蛋白肽可以恢复为可溶性蛋白质。

在这项研究中,自由氨基酸的产量为2.64毫克/毫升,紫外分光光度法检测色氨酸和酪氨酸后14天的退化过程。蟹道et al。2]报道可溶性蛋白质和氨基酸的浓度在退化的羽毛假单胞菌microphilus和明串珠菌属sp.后10、20和30天的退化,蛋白质含量最高为0.548和0.118毫克/毫升假单胞菌microphilus和明串珠菌属sp.分别在30天内,最大氨基酸浓度为1.992和1.682毫克/毫升假单胞菌microphilus和明串珠菌属sp.分别在同一时间。南et al。21)进行了一项研究在羽毛在高温条件下的降解Fervidobacterium islandicumAW-1发现,降解后产生的氨基酸组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸(属于羽毛)。他们还发现必需氨基酸如蛋氨酸和色氨酸,出现在低羽毛角蛋白的浓度。

在其他的研究中,人们已经发现,经过五天的退化的鸡毛Stenotrophomona maltophilia氨基酸的浓度是2298.8μM和检测氨基酸色氨酸和酪氨酸的存在除了异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和华菱[20.]。

分子识别

形态学研究显示,三个分离菌株革兰氏阴性细菌的形式球菌和杆菌。的序列分析16 s rDNA显示高序列标识的两个亚种粪产碱杆菌属同源性(96%和97%)菌株1和Brebundimonas diminuta2(94%)的压力。序列比较一点点加入数字KX118704 KU494828 KF453789基因库。

的第一份报告物种粪产碱杆菌属可以降解羽毛发表Yusuf et al。33]。然而,到目前为止没有报告物种Brebundimonas diminuta有这个能力。

细菌属Brevundimonas和产碱杆菌属是革兰氏阴性,oligotrophs和他们分别列为alphaproteobacteria和betaprotobacteria (43]。属产碱杆菌属是一种细菌在酒吧或者芽孢杆菌(33];被发现在土壤、水和废水;也,其抗汞能力已被观察到,因为它可以减少Hg0 Hg2 +。这种细菌在环境是很重要的,因为有能力生产生长调节剂植物生长激素,细胞分裂素、赤霉素、乙烯或脱落酸,刺激植物生长,而且它已报告降解农药和碳氢化合物,烷烃和聚芳化合物(多环芳烃)44]。

Dille et al。45)隔离Brevundimonas从鸟的羽毛灯芯草雀hyemalisR2A(þ环己酰亚胺)中,这种细菌生长在角蛋白和表现出脂肪酶活性,表明这些酶分离株可降解羽毛。

本身没有一个三物种细菌鉴定在这个研究能够完全降解羽毛(数据未显示);然而当三个培养细菌一起行动,他们能够降解羽毛,包括脊柱,在11天。这些数据显示一个类似的行为报道Vasileiva-Tonkova et al。26)和Ichida et al。33),他提到,混合文化的放线菌芽孢杆菌sp.和链霉菌属sp.降解羽毛更迅速和完全相比纯菌株的文化。值得注意的是,经过48小时的增长,可溶性蛋白的浓度与混合曾两次获得高于纯菌株获得的文化。

扫描电子显微镜

电子显微镜的研究表明,在第一阶段,细菌降解羽毛的羽小枝(9天);在第二个阶段,细菌形成的圆和椭圆结构(图5)在脊柱为了降低它。对这些结构的研究揭示了细菌的存在形式的细菌纤维的脊柱在降解过程中,和大量的细菌降解后的沉积物形成(图6)。

一些研究已经使用扫描电子显微镜来验证不同微生物的降解羽毛的(15,18),例如Al-Musallam et al。23人意识到羽毛降解利用真菌,显示密度生物膜的真菌菌丝绑定羽毛分数,获得在三周内分解的羽毛。此外,宋et al。20.]研究鸡毛的退化Stenotrophomonas maltophiliaR13,通过扫描电镜和验证了退化。他们报告说,羽小枝退化到2天的孵化和孵化的羽轴,4天;他们还报告一个聚合的细菌嵌入在一个细胞外基质坚持降解表面。

结论

两个亚种粪产碱杆菌属和Brebundimonas diminuta在这项研究中被测序。细菌的培养用于这项研究显示高潜力用于总降解羽毛(包括脊柱)。脊柱周围形成圆形或椭圆结构允许细菌降解完全。方差分析分析表明,温度和碳源对降解有显著影响鸡的羽毛。蛋白质和氨基酸作为副产品从鸡毛获得生物降解菌株可能感兴趣的生物技术。

确认

我们感谢瓦伦西亚Ramirez瓦伦汀的技术支持(TSU),维多利亚Enciso Tenorio (IBT)。我们感谢半径标注。希尔达Zavaleta Mancera骄傲地指出,现在联邦区的Colegio de Postgraduados提供技术和资金支持,扫描电子显微镜的使用。

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