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，卷:9(5)

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吖啶橙染色鉴定体外病毒感染细胞和细胞DNA

罗纳德·B^＊

内布拉斯加大学文理学院达勒姆科学中心，美国内布拉斯加州奥马哈市道奇街6001号，68182

*通信:

罗纳德·Bartzatt68182美国内布拉斯加州奥马哈市道奇街6001号达勒姆科学中心，内布拉斯加州大学文理学院电话:4025542651,电子邮件: (电子邮件保护)

摘要

染料的使用也在增加医学部门。在临床诊断中，染料在许多对人类患者进行的医学测试中起着至关重要的作用。大多数异常可以通过照片或自动化仪器观察到。吖啶橙也被称为吖啶橙碱，吖啶橙NO和碱橙14。吖啶橙染色的有效性的证据在这里提出，以确定单链RNA的存在病毒艾滋病毒白人血统细胞和RAJI细胞。在染色之前协议的细胞安装在玻璃载玻片上并使用Carnoy溶液固定。的细胞裱好的都染色了。当用暗场紫外线显微镜检查时，荧光(如果有的话)表明存在或不存在病毒粒子。的相对数量细胞被感染的和未被感染的艾滋病毒可以估计。荧光发射明显，容易观察。荧光发射足够强，可用于照相记录。

关键字

吖啶橙;艾滋病毒;染色;HTLVIII;白细胞

缩写

艾滋病毒:人类免疫缺陷病毒;AO:吖啶橙

简介

吖啶橙(AO)染料分别通过插层作用和静电吸引作用与DNA和RNA相互作用[1］．这种染料具有细胞渗透性，可与双链DNA插层相互作用并发出绿色荧光，而静电单链RNA和DNA则发出红色荧光[1］．吖啶橙染色是一种有效的测定方法细胞凋亡(发生在多细胞生物中的细胞程序性死亡过程)[1］．在紫外线照射下和暗场显微镜下，病毒粒子，无论是单链还是双链，都将显示发射并可观察到。吖啶橙是用于全血研究的最常见的荧光色素[2-4]，网织红细胞计数[5]，以及用于观察和鉴定核酸[6］．AO已被应用，并被发现是有效的研究阴道和子宫颈癌组织(7]、血液寄生虫的调查[8]，以及各种仪器自动化技术[9］．吖啶橙染色是用来检查湿坐垫诊断t .鞘突感染(10］．临床医生使用AO来正确诊断t .鞘突由于对众多患者具有早期发现的优势t .鞘突［10］．AO染色不能区分内部pH值不同的酸性囊泡，但它具有光毒性，可使载染囊泡破裂[11］．这种染色方法已应用于尿液细菌感染的快速筛查，并利用自动化系统[12］．平行革兰氏染色法已成功地描述和表征感染性角膜炎[13］．这种染色已被使用，对早期检测阳性血培养有效[14］．一些研究人员用AO进行检测，结果表明它优于革兰氏染色微生物在脑脊液和各种临床标本中[15］．

吖啶橙染色法已成功用于临床诊断和检测恶性疟原虫［16］．这种染色方法被反复成功地用于血液涂片检查是否存在疟疾寄生虫［17］．存在兽医学应用，AO染色已用于检测牛呼吸道合胞体的存在病毒［18］．虽然逆转录酶试验已被用于检测人免疫缺陷病毒(HIV) (19的检测艾滋病毒AO染色可完成感染淋巴细胞的染色。以前的研究已经证明了检查实验室细胞系的有效性[20.，21］．利用吖啶橙染料将继续对临床诊断和实验室研究有用。

实验

仪器及试剂

所有使用的试剂均来自SIGMA (SIGMA - aldrich, PO Box 14508, St. Louis, MO 63178美国)。采用蔡司紫外显微镜进行暗场显微镜检查。利用尼康35mm相机与合适的显微镜接口获取图像。所有图像在400X放大倍率下用EKTA铬膜在200asa下采集。

组织培养

对于人淋巴细胞的生长，所使用的培养基是含有10%胎牛血清的90% RPMI 1640。抗菌药物为青霉素(100单位/mL)和链霉素(100 μg/mL)。

细胞处理和染色的解决方案

磷酸盐缓冲盐水(PBS): 1升溶液:氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，磷酸钠，双碱无水1.44 g，磷酸钾，单碱0.24 g，然后过滤杀菌。

Carnoy解决方案:乙醇6ml，氯仿3ml，冰醋酸1ml。

氯化钙(0.1M):溶解11.09 g氯化钙₂放入1l蒸馏水中。

硫酸镁(0.2M):溶解4.93 g MgSO₄

磷酸缓冲液:0.067摩尔Na₂HPO₄和KH₂阿宝₄在蒸馏水(pH值6.0)中。

染色前的l -赖氨酸处理:有必要在染色前用1%的l -赖氨酸在蒸馏水中处理这类玻片，以确保达到目标细胞通过染色程序附着在载玻片上。1)取一个新鲜干净的玻片，在1%赖氨酸溶液中浸泡至少5分钟;2)用镊子或带手套的手取出载玻片，以保持清洁，并让其风干。

吖啶橙溶液:0.01%吖啶橙磷酸盐缓冲液(pH值6.0)。

染色的协议

如果细胞用在组织培养上都是附着的细胞用0.05%胰蛋白酶在生理盐水中分离。具体染色程序方法如下:1)清洗感染部位细胞在PBS和球软低速度;2) Resuspend细胞在最小的PBS和滴细胞在涂有l -赖氨酸的载玻片上附着细胞;3)晾干;4)用Carnoy液固定载玻片4分钟;5)连续浸泡95%、80%、70%、50%乙醇，分别快速处理1分钟;6)用0.002摩尔MgSO冲洗1分钟₄解决方案;7) 1%醋酸冲洗1分钟;8)用0.002摩尔MgSO冲洗₄溶液1分钟;9)在pH为6.0的磷酸盐缓冲液中冲洗2分钟;10) 0.01%吖啶橙溶液在相同的磷酸盐缓冲液中染色3分钟;11)在相同的磷酸盐缓冲液(pH值6.0)中漂洗至少3分钟;12)在含有0.004摩尔MgSO的0.1摩尔氯化钙溶液中分化₄10分钟;13)在pH为6.0的磷酸盐缓冲液中冲洗10分钟;14)沥干多余液体，晾干;15)在暗场紫外显微镜下检查。

结果与讨论

染料的使用也在增加医学部门。在这里，染料是许多人体医学测试的重要成分。这些染料与最新的诊断设备相配合，可以在对患者进行的测试中实现完美的处理和高精度。大多数微生物或细胞异常可以在照片或自动化仪器中看到。准确的组织评估有助于正确的诊断，并允许更直接的实施治疗计划。

吖啶橙化合物(N,N,N'，N'-四甲基吖啶-3,6-二胺)也被称为:吖啶橙碱，吖啶橙NO，碱橙14,euchrine Rhoduline orange，和Rhoduline orange N [1，11，19］．它的化学式为C17H19N3，公式重量为265.36，是一种橙色粉末。它有一个中心吡啶环，两侧是带有叔胺取代基的芳香环，这种结构使它能够作为荧光阳离子染料[22，23］．微生物感染的识别/诊断是临床护理的一个主要组成部分，使用染料制备标本可以快速准确地识别疾病。这是特别的情况艾滋病毒发病率和患者。适当收集传入患者的全血(未凝固)，并有方法地制备固定的血细胞，然后进行吖啶橙染色(根据材料和方法)，可以显示实际感染的白色血液细胞(见图1)．图1显示了人白细胞染色过程的结果细胞暗场显微镜检查。观察到的红色荧光为艾滋病毒感染的白细胞这些血液将与未感染的白色血液鲜明地区别开来细胞会发出黄色或绿色。这很容易看到，而且比较有特色。

白色的血液细胞在图2它们都发出绿色荧光，这是双链DNA的描述，而不是单链RNA病毒艾滋病毒。绿色荧光鲜明地映衬着暗场显微镜所特有的深色背景。的艾滋病毒负细胞可以清楚地识别和估计，以比较患者血液样本的感染/非感染程度。

吖啶橙染色法用于检测单链RNA潜在存在的有效性的进一步证据病毒的存在。在图3，是附加板的固定细胞附着在玻片上(见实验)，具有高密度的现代人类白细胞。这是在图4，其中，更高的焦点放在固定上细胞是完成了。对非感染者和非感染者仍有明确的定义艾滋病毒感染的白细胞这里，是人类的白色血液细胞必须适当地固定在载玻片上，这是通过使用Carnoy溶液来完成的(见实验)。

l -赖氨酸用于玻片的预制备是非常重要的。玻片上的l -赖氨酸涂层极大地保证了所需的效果细胞在染色步骤之前牢固地附着在玻片上。

用来连接人类的白色血液细胞对于载玻片，l -赖氨酸浓度为1%的溶液是适当制备人体血液样本的最低浓度(见实验)。在玻片上牢固附着血细胞样本是固定玻片前重要的准备工作细胞去看幻灯片。

Carnoy固定液方法被证明是适合和有效的人白细胞固定(见实验)。的细胞牢固地附着在玻璃片上。强烈的依恋细胞在使用吖啶橙的染色步骤之前是非常重要的。附加的细胞在将吖啶橙染料注射到固定细胞的过程中，必须通过若干步骤与各种混合物混合。染色过程应使用保护手套进行，以便能够抓住和处理易碎的玻片。载玻片的搬运必须避免与固定物接触或摩擦LD乐动体育官网细胞从玻璃滑梯上。此外，将载玻片从一个溶液转移到另一个溶液时应小心，不要使制备好的载玻片受到创伤或手套、镊子等意外接触。LD乐动体育官网

RAJI的细胞系是一个连续的人细胞系这源于造血源(24］．RAJI的细胞系产生一种不同寻常的爱泼斯坦-巴尔病毒病毒可以转化脐带血淋巴细胞[24］．这是非常独特的细胞系通过描述的染色方法放置(见实验)。这些细胞在玻片上有效固定，Carnoy溶液固定，然后吖啶橙染料插入，均成功。所示图5RAJI细胞类型是否未被HIV感染，但显示出非单链RNA感染的特征发射病毒艾滋病毒这是一种绿色荧光(看到了吗图5)．发射信号很明显，很容易从邻近物质中分辨出来。吖啶橙的使用在临床应用中是有效的。这里显示的染料是有效的识别单链RNA的存在病毒艾滋病毒。染料可以注入细胞使用l -赖氨酸固定在载玻片上，使用Carnoy溶液固定(见实验)。

微生物感染的诊断对疾病的及时有效治疗具有重要意义。吖啶橙已被证明是有用的自动化仪器诊断程序以及手工方法。在这里，该技术，以及所描述的附着和固定，显示出单链RNA的存在病毒艾滋病毒。进一步研究染料染色的其他应用可能显著有助于识别微生物病原体的存在。

结论

吖啶橙染料的应用已被证明在临床诊断微生物感染和观察细胞成分方面具有许多优势。吖啶橙染色在这里被证明是有用的区分艾滋病毒单链RNA病毒存在宿主细胞双链DNA的粒子。单根艾滋病毒在白色血液中可以检测到颗粒细胞RAJI和细胞(人类细胞系从造血起源)。人类白色血液细胞未感染艾滋病毒可以从细胞在增殖艾滋病毒粒子。荧光足够清晰，可以估计感染病毒的人数细胞的数量相比细胞不受感染。将继续探索吖啶橙染料的临床应用潜力。

确认

这项工作是在加州大学圣地亚哥分校医学中心完成的，美国加州圣地亚哥，S.D.G.

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